大鼠坐骨神经切断后谷氨酰胺合成酶在脊髓后角内的表达变化.pdf

· 1 8 · 大鼠坐骨神经切断后谷氨酰胺合成酶 在脊髓后角内的表达变化 周聪发h ，易智华¨，潘爱华2 ，刘曾旭h ( 1 南昌大学医学院a 解割教研室；b 护理系，南昌3 3 0 0 0 6 ； 2 中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系，长沙4 1 0 0 1 3 ) 摘要：目的观察坐骨神经切断后不同时间点脊髓后角内谷氨酰胺合成酶( G s ) 的表达，探讨G s 对神经元的保护 机制。方法4 8 只S D 大鼠随机分为实验组( n = 4 0 ) 和对照组( 行一8 ) ，其中实验组右侧坐骨神经切断，大鼠手术后 分别存活1 、3 、7 、1 4 和2 1d ( 每时间点8 只大鼠) 。免疫组织化学方法检测脊髓后角内G S 的表达变化。结果G S 主要表达于神经胶质细胞胞体内。坐骨神经切断后G S 表达开始增多，7d 时G S 表达最显著，之后G S 表达下降， 实验组各时间点与对照组相比具有统计学意义( P O 0 5 ) 。 结论坐骨神经切断后脊髓后角内G S 表达升高，这可能是G S 对神经元保护作用的反应。 关键词：后角；谷氨酰胺合成酶；神经胶质；神经元 动物，实验；s D 大鼠 中图分类号：R 一3 3 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 一2 2 9 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 一o o l 8 一0 3 C h a n g e so fG l u t a m i n eS y n t h e t a s eE x p r e s s i o ni n P o s t e r i o rH o r no fS p i n a lC o r da f t e rS c i a t i cN e r V eC u t Z H O UC o n 酽f a l I ，Y IZ h i h u a l ，P A NA i _ h u a 2 ，L I UZ e n g - x u l I ( 1 a D P 户口，m e n zo ，A n 口t o ，n y ；1 b N M r s i 7 2F n c 乱Z z 了，M e d i c 口ZC o Z o g PD ，N 口n c n n gU 咒i 勘P r s i y ， N 口咒f 口咒g3 3 0 0 0 6 ，C ，l i 赡口；2 D e 户口r 7 n P 咒o ，A 靠口0 7 “ y & N P “，0 6 i o Z o g y ， X i 口咒g y 口S f o o Zo ， 彳P d i f i P ，C P 咒，口ZS o M f U 矗i 伽r s i y ，C 口，z g s 口4 1 0 0 1 3 ，( 冼i 咒口) A B S T R A C T ：o b j e c t i v eT oo b s e r v et h ec h a n g e so fg l u t a m i n es y n t h e t a s e ( G S ) e x p r e s s i o ni np o s t e r i o rh o r no fs p i n a lc o r da td i f f e r e n tt i m ea f t e rs c i a t i cn e r v ec u ta n da p p r o a c ht h em e c h a n i s mo f G Sp r o t e c t i o nt on e u r o n M e t h o d s F o r t y e i g h tS Dr a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t oe x p e r i m e n t g r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p I nt h ee x p e r i m e n tg r o u p ，r i g h ts c i a t i cn e r V ew a so p e r a t i o ns i d e a n dl e f ts c i a t i cn e r v ew a sc o n t r o ls i d e A f t e rs c i a t i cn e r v ec u t ，r a t ss u r v i v e df o r1 、3 、7 、14a n d21 d a y s ，t a k eo u t8r a t si ne a c ht i m e T h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym e t h o dw a se m p l o y e dt od e t e c tG S e x p r e s s i o nc h a n g e R 皓u l t sG Sm a i n l ye x p r e s s e di nt h eb o d yo fg l i a lc e l l G Se x p r e s s i o nw a si n c r e a s e da t1d a ya n dt h em o s tp r e d o m i n a n c ea t7d a y sa f t e rs c i a t i cn e r v ec u t ，t h e nG Se x p r e s s i o n d e s c e n d I th a ds t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb yc o n t r a s t i n gb e t w e e n1 、3 、7 、14 、21d a y so fe x p e r i m e n t g r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p ( P O 0 5 ) C o n c l u s i o n T h ep h e n o m e n o nt h a tG S e x p r e s s i o ni np o s t e r i o rh o r no fs p i n a lc o r dw a se l e v a t o r yi sl i k e l yar e a c t i o no fG St op r o t e c tn e u r o na f t e rs c i a t i cn e r v ec u t K E YW o R D S ：p 稍t e r i o rh o m ；g I u t a m i n es y n t h e t a 驰；g l i a ；n e u r 帆；a n i m a l s ，I a b o r a t o r y ；S Dr a t s 谷氨酰胺合成酶( G S ) 作为一种酶广泛存在中 枢神经系统内，过去认为G S 是特异性分布于星形 ( 胶质) 细胞中，被看作是星形( 胶质) 细胞的一种标 记物，后来在周围神经节内卫星细胞、视网膜 M n l l e r 胶质细胞和少突神经胶质细胞1 3 都发现G S 存在。 收稿日期：2 0 0 8 一0 4 2 8 作者简介：周聪发( 1 9 7 4 一) ，男，硕士研究生，讲师，主要从事应用解剖学的研究。 万方数据 江西医学院学报2 0 0 8 年第4 8 卷第6 期鼻c f n A c 口d P m f 口PM P d i c f H 口PJ f n 甩g “2 0 0 8 ，V o l4 8 ，N o6·1 9 · 谷氨酸是中枢神经系统内主要的一种兴奋性神 经递质，在正常生理条件下，谷氨酸在神经突触末梢 释放到突触间隙内，通过起弥散功能激活神经元和 神经胶质上谷氨酸受体，产生正常生理效应，但是同 时有8 0 谷氨酸被神经胶质上转运体运输而快速 摄取，在其胞内被G S 代谢产生谷氨酰胺，预防在突 触间隙内积累产生神经毒性效应导致神经元损伤或 死亡引。有报道 3 3 在脊髓L 。完全横断后7d 时G S 和谷氨酰胺在脊髓内表达都上调，认为两者上调是 清除胞外过剩谷氨酸的表现。至今尚未发现关于周 围神经损伤后G S 在脊髓灰质内的表达变化的报 道，本文通过观察大鼠坐骨神经切断后不同时间点 G S 在脊髓后角内的表达变化，进一步探讨G S 对神 经元的保护机制。 1 材料与方法 1 1 动物分组 健康S D 大鼠4 8 只，由中南大学动科部提供， 体质量1 8 0 2 2 0g ，雌雄不限。实验动物随机分为 实验组( ，z = 4 0 ) 和对照组( 7 z 一8 ) ，其中实验组右侧 行坐骨神经切断手术，术后分1 、3 、7 、1 4 和2 1d5 个 不同时间点组，每个时间点8 只大鼠。 1 2 实验组大鼠动物模型制作 麻醉后固定，右后肢股中部纵切口约3c m ，梨 状肌下暴露坐骨神经，距梨状肌下孔O 5c m 处切除 O 5c m 神经段，将远断端翻转固定于肌肉中，注意 不要损伤神经下方的结构。术后抗生素预防感染， 分别在术后1 、3 、7 、1 4 和2 1d 处死。 1 3 组织制备 麻醉后先以生理盐水5 0 1 0 0m L 快速灌注， 然后用含4 多聚甲醛的O 1m o l L 的P B ( p H 7 2 7 4 ) 灌注固定。取L 。一。相应脊髓节段，后固 定2h ，用0 1m o l LP B 配制梯度蔗糖溶液内直至 标本沉底( 4 ) 。用O C T 包埋剂包埋，冰冻切片机 切片，片厚1 5 弘m ，干透后保存于一2 0 冰箱中备 用。 1 4 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色均采用漂浮法。一抗为单克 隆鼠抗G S 抗体( 1 ：5 0 0 ，S i g m a ) ，4 摇床上孵育 2 4h ，二抗为生物素化马抗鼠( 1 ：2 0 0 ，北京中衫金 桥生物技术有限公司) ，3 7 摇床孵育2h ，三抗为 生物素一卵白素一辣根过氧化酶复合物( A B C 液1 ： 2 0 0 ，北京中衫金桥生物技术有限公司，用前3 0r n i n 配 制) 3 7 摇床孵育1h ，每次孵育后均用o 0 1n D l L P B S ( p H 7 4 ) 充分洗涤。D | A B 显色( 0 0 5 的n 蟠+ 0 0 1 的H z O z ，避光) 3 5m i n 镜下控制染色深 度。常规脱水、透明封片，M o t i c 显微镜观察、照相。 1 5 数据收集和分析 每个标本随机取5 张L 。一。脊髓切片，M o t i c 显 微镜( 德国M o t i c 公司) 下每张切片随机取5 个高倍 视野( 2 0 0 ×) ，摄片后用M o t i c3 2 图像分析软件测 量脊髓后角内G S 免疫反应阳性神经胶质细胞数 目。实验数据以均数±标准差( i ±s ) 表示，通过 S P S S l 3 o 软件包对各组实验数据比较用方差分 析。P 0 0 5 ) ，见表1 。 表l 脊髓后角G s 免疫阳性神经胶质细胞数 ( i 士s ，个) 与对照组比较，* P o 0 5 3 讨论 脊髓内神经胶质细胞广泛存在神经元胞体周 围，且与神经元交互穿插，对神经元有支持、营养、保 护等功能，在维持神经元的正常形态和功能中发挥 着重要作用。本实验观察正常的脊髓横断面上G S 表达结果与相关报道 1 一致。坐骨神经切断后1d 观察脊髓后角内G S 表达开始增加，7d 时G S 表达 上调达到最高值，较对照组有显著性差异( P O 0 5 ) ， 提示坐骨神经切断损伤后，谷氨酸的大量释放同样 诱导对侧神经胶质G S 表达上调，共同参与神经元 的保护作用，这可能与谷氨酸释放出来后弥散特征 有关。 鉴于坐骨神经切断后脊髓后角内G S 表达的这 种时空变化，作者认为这与坐骨神经切断后脊髓内 谷氨酸介导的兴奋性毒性有关，也证实周围神经损 伤后G S 参与对神经元的保护作用，为周围神经损 伤后临床制定治疗策略提供实验依据。 参考文献： 1 潘爱华，严进，张阳德，等K i r 2 1 在大鼠脊髓中的分布和表达 J 解剖学杂志，2 0 0 3 ，2 6 ( 6 ) ：5 1 9 5 2 z 2 B e n n e t tGJ u p d a t eo nt h eN e u r o p h y s i o l o g yo fP a i nT r a n s m i s s i o na n dM o d u l a t i o n ：F o c u s0 nt h eN M D p 卜r e c e p t o r J JP a i n S y m p t o mM a n a g e ，2 0 0 0 ，1 9 ( 1 ) ：Z 一6 3 B e n t o nRL G l u t a m i n es y n t h e t a s ei ns p i n a lw h i t ea n dG r a y M a t t e r7D a y sF o l l o w i n gs p i n a lC o r dI n j u r yi nR a t s J N e u r o s c i e n c e ，2 0 0 0 ，2 9 1 ( 1 ) ：1 - 4 4 F a p o o q u eM ，H i j I e r e dL ，H o I t zAc h n g e so fE x t r a c e l I u l a rL e v e l s 0 fA r n i n oA c i d sa f t e rG r a d e dC 0 m p r s i o nn a u I mt ot h eS p i m l C 0 r d ；a nE x p e r i m 朗t a ls t u d yi nt h eR a tu s i n gM i c r _ 0 d i a I y s i s J J N e u r o t r a u n 诅。1 9 9 6 。1 3 ：5 3 7 5 4 8 5 R e i s f e l ds ，v a r d i n m o nL c d lt oc e nC o n t a c t sC o n t r o lt h en 柚一 s c r i p t i o nA c t i “t yo ft h eG l u c o c o r t i c o i dR e c e p t e r J M dE n d o c r i n o l ，1 9 9 4 ，8 ( 9 ) ：1 2 2 4 一1 2 3 3 6 L e eSJ ，D r a b i kK ，v a nw a g o n e rNJ ，e ta 1 I c A M 一卜i n d u c e d E x p r e s s i o no fP r o i n f a m m a t o r yC y t o k i n e si nA s t r o c y t e s ：I n v · o l e m e n to fE x t r o c e l l u l a rS i g n a h e g u l a t e dK i n a s ea n dP 3 8M i t o g e n - a c t i v a t e dP r o t e i nK i n a s eP a t h w a y s J JI m m u 脚1 a l ， 2 0 0 0 ，1 6 5 ( 8 ) ：4 6 5 8 4 6 6 6 7 N a p p e rGA ，P i a n t aMJ ，K a l l o n i a t i sM R e d u c e dG l u t a m a t e U p - t a k eb yR e t i n a lG 1 i a lC e l l sU n d e r1 s c h e m i c H y p o x i cC o n d i t i o n J Jv i sN e u m s c i ，1 9 9 9 ，l ( 1 6 ) ：1 4 9 一1 6 0 8 b b o wBI ，S o u b aww 。A b c o u w e rsF G l u t a m i n eS y n t h e t a s e E x p r e s s i o ni nM u s c l ei sR e g u l a t e db yT r a n s c r i p t i o n a la n d P o s t t r a n s c r i p t i o n a lM e c h a n i s m 5 J A mJP h y s i o I ，1 9 9 2 ，2 7 6 ( 6 ) ：E 1 1 3 6 一E 1 1 4 5 ( 责任编辑：罗芳) ( 上接第1 7 页) 同时本研究还成功的运用同尾酶策略，实现了基因 片段的定向连接，最终完成了重组质粒p l 】【s r r h 嘲t T E G F P 的构建。总之，为了增强肿瘤基因治疗的 靶向性，作者采用了把目的基因靶向转移和目的基 因靶向表达结合起来的策略，利用含有5 个S p l 结 合位点和2 个E 盒的3 1 9b p 的h T E R T 启动子核心 序列和仅感染分裂细胞的逆转录病毒载体，成功地 构建了h T E R T 启动子调控E G F P 的表达的逆转录 病毒载体，并观察了其在人宫颈癌H e l a 细胞中的 表达情况，为下一步研究肿瘤的靶向基因治疗，提供 了基础。 ( 本课题在江西省分子医学重点 实验室完成，特此致谢) 参考文献： 1 S h a yJw 。B a c c h e t t is As u r v e yo fT e l o m e r a s eA c t i v i t yi nH u m a nC a n c e r J E u rJc a n c e r ，1 9 9 7 ，3 3 ( 5 ) ：7 8 7 7 9 1 2 H o r i k a w aI ，c a b l ePL ，A f s h a r ic ，e ta 1 c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h eP r o m o t e rR e g i o no fH u m a nT e l o m e r a s eR e v e r s e T r a n s c r i p t a s eG e n e J c a n c e rR e S ，1 9 9 9 ，5 9 ( 4 ) ：8 2 6 - 8 3 0 3 w a n gJH ，L i uxY T a r g e t i n gs t r a t e g i e si nc a n c e rG e n eT h e r a p y J A c t aB i o c h mB i o p h y ss i n ，2 0 0 3 ，3 5 ( 4 ) ：3 1 1 3 1 6 4 G uJ ，F a n gB T e l o m e r a s eP r o m o t e r - d r i V e nc a n c e rG e n eT h e r 一 印y J c a n c e rB i o lT h e r ，2 0 0 3 ，2 ( s 1 ) ：S 6 4 一S 7 0 5 T a k a k u r aM ，K y os ，K a n a y aT ，e ta 1 c l o n i n go fH u m a n T e l o m e f a s eR e s e r v e dT r a n s c r i p t a s e ( h T E R T ) G e n eP r o m o t e ra n d l d e n t i f i c a t i o no fP r o x i m a lC o r eP r o m o t e rS e q u e n c e sE s s e n t i a l f o rT r a n s c r i p t j o n a lA c t i v a t i o ni nI m m o r t a l i z e da n dC a n c e r C e l l s J C a n c e rR e s ，1 9 9 9 ，5 9 ( 3 ) ：5 5 1 5 5 7 6 C h a l f i eM ，T uY ，E u s k i r c h e nG ，e ta I G r e e nF l u o r e s c e n tP r o t e i na saM a r k e rf o rG e n eE x p r e s s i o n J S c i e n c e ，19 9 4 ，2 6 3 ( 5 1 4 8 ) ：8 0 2 8 0 5 ( 责任编辑：胡炜华) 万方数据 金黄色葡萄球菌D N 抗肿瘤免疫的实验研究( 正文见第2 8 页) l 目11 岱、B c GD N A3 组肿瘤大小情况 目3D N A 组肿瘤组织病理改变( H E 目2T E s 组肿瘤组织病理改变( H E ) 目4B c G 组肿瘤组织病理改变( H E 大鼠坐骨神经切断后谷氨酰胺台成酶在脊髓后角内的表达变化( 正文见第1 8 贾) 对目组 实验组术后ld实验组术后3d 女验组术后7d宾验组术后1 4d 实验组术后2 ld 目1 对月组与实验组坐骨神切断后不问时间点脊髓后角内G s 的免癌表达( 免疫组织化学染色 万方数据