溶栓素样品精纯方法的研究.pdf

4 参考文献 1 Behague I，Poiriwe O，Nicaud V，et al . Beta fibrinogen gene polymor- phisms are associated with plasma fibrinogen and coronary artery disease in patients with myocardial infarction. The ECTIM study Etude Cas Te- moins surl infarctus du MyocardeJ . Circulation， 1996； 93： 440-9. 2 Tybjaerg HA，Agerholm LB，Humphries SE，et al . A common mutation in the -fibrionogen promoter is an independent predictor of plasma fi- brinogen，but not of ischemic heart disease . A study of 9127 individuals based on the Copenhagen city heart study J . J Clin Invest，1997； 99： 3034-9. 3 Carter AM， Catto AJ， Bamford JM，et al . Gender specific association of the fibrinogen b-448 polymorphism fibrinogen levels and acute cerebro- vascular disease J . Art Throm Vasc Biol， 1997； 17： 589-94. 4 Thomas AE， Green R， Kellher CH，et al . Variation in the promoter re- gion of the -fibrinogen gene is associated with plasma fibrinogen levels in smokers and non-smoker J . Thromb Haemost， 1991； 65： 487. 5 Humphries SE，Shu Y，Talmud P，et al . European Atherosclerosis Re- search Study：genotype at the fibrinogen locus （g455a beta gene ）is as- sociated with differences in plasma fibrinogen levels in young men and women from different regions in EuropeJ . Ar Throm Vasc Bio， 1995； 15： 96-104. 6 Iso H，Folsom AR，Winkelmann JC，et al . Polymorphisms of the fi- brinogen gene and plasma fibrinogen concentration in Caucasian and Jap- anese population samples J. Thromb Haemost， 1995； 73： 106-11. 7 Green F，Hamsten A，Biomback M，et al . The role of beta fibrinogen genotype in determing plasma fibrinogen levels in young survivors of myo- cardial infarction and healthy controls from Sweden J . Thromb Haem- ost， 1993； 70： 915-20. 2005-09-22 收稿 2005-10-27 修回 （编辑 张 慧） 溶栓素样品精纯方法的研究 王 昭 李 奇 迟秀梅 洪 敏 （吉林大学基础医学院生物化学教研室， 吉林 长春 130021） 摘 要 目的 建立一种合适的纯化方法， 以利于进一步研究溶栓素的结构分析和酶化学性质。方法 利用电泳技术提纯， 用 S2251 作为底 物验证纯化前后样品的活性变化， 用高效液相色谱 （HPLC） 技术检验纯化效果。结果 纯化前后样品活性无变化， 纯度得到进一步提高。结论 这 是一种切实可行的纯化方法， 解决了普通实验室样品需要高度纯化的难题。 关键词 溶栓素； S2251； 高效液相色谱 中图分类号 R-331 文献标识码 A 文章编号 1005-9202 （2005） 12-1502-02 基金项目： 吉林省计委资助课题 （20050251） 通讯作者： 洪 敏 （1945-） ， 男， 教授， 博士生导师， 主要研究蛋白质工程 和生物制药。 作者简介： 王 昭 （1972-） ， 男， 在读博士， 工作于佳木斯大学基础医学 院生物化学教研室， 主要研究蛋白质工程和生物制药。 溶栓素样品纯度已达到了卫生部规定的新药申报要求。 但欲分析该酶的组成、 结构以及其酶化学性质都需要将样品进 一步纯化。本文试图建立一种合适的溶栓素纯化方法。 1 材料与方法 1. 1 材料 溶栓素样品 （本教研室提供） ； 三羟甲基氨基甲烷 （Tris） 、 丙烯酰胺、 甘氨酸 （Sigma 公司） ； 乙腈、 三氟乙酸 （TFA） （天地公司） ； N， N， N， N-四甲基乙二胺 （TEMED）（Merk 公司） ； S2251 （Fluka 公司） ； EDTA、N， N-甲叉双丙烯酰胺、 过硫酸铵等 均为国产分析纯。 1. 2 方法 1. 2. 1 溶栓素样品纯化 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1， 2：灌制3 mm 厚的 5%聚丙烯酰胺凝胶， 插单孔梳子， 凝固后取下梳子， 在电泳槽中加入 8. 9%Tris-甘氨酸缓冲液， 以 15 mA 预电泳 15 min。用上样缓冲液 400 µl 溶解约 4. 06 mg 样品， 在梳孔中均 匀上样。在 3 下以 30 mA 恒流电泳， 待样品进入凝胶后， 改 为 60 mA 恒流电泳。待溴酚蓝电泳至凝胶前端边缘时关闭电 泳， 取出凝胶。将凝胶左右两侧各切下约 1. 5 cm， 用考马斯亮 兰 G-250 在 40条件下快速染色。待染出条带后， 将两条染色 后的凝胶在原凝胶位置上对齐， 确定溶栓素位置， 并将未染色 的凝胶上的含有溶栓素的条带切下， 备用。将余下的凝胶进行 染色、 脱色以确定切取的条带上溶栓素是否纯净。转移电 泳： 将透析袋分别用 50% 乙醇和 10 mmol/ L NaHCO3各浸泡 2 次， 每次约 1 h， 再用 EDTA 处理。最后用三蒸水冲洗干净， 备 用。将透析袋注满 8. 9% Tris-甘氨酸缓冲液， 用药匙将含有溶 栓素的凝胶条带装入透析袋。将凝胶固定在透析袋的中间位 置， 留下适量的缓冲液， 并尽量赶走凝胶周围的气泡。在垂直 转移电泳槽的 “三明治” 夹板中依次叠放海绵、 滤纸、 凝胶、 滤 纸、 海绵， 并在凝胶的周围用保鲜膜封堵。将夹板插入电泳槽， 注入 8. 9% Tris-甘氨酸缓冲液， 用 160 mA 恒流 3 下电泳约 4 h。 取出透析袋， 轻轻揉搓凝胶两侧透析膜， 收集袋内液体， 并 用三蒸水清洗袋内容物， 液体一并收集。取出胶条， 用考马斯 亮兰 G-250 染色、 脱色， 以确定转移效果。样品除盐： 制备 G- 25 柱， 用去离子水平衡约 4 5 个柱体积后上样。用去离子水 洗脱， 收集波峰位置洗脱液。用电导仪测定洗脱前后样品的电 导率， 以确定除盐效果。样品冻干浓缩。用 Bradfford 法测 定浓缩后样品浓度 3。将样品用小冻干安瓶分装， 冻干， 备 用。 ·2051·中国老年学杂志 2005 年 12 月第 25 卷 1. 2. 2 溶栓素比活力大小的检测 在室温条件下测定， 调整 好分光光度计使其处于使用状态， 取两个比色杯 （带盖， 光程 0. 5 cm） 分别加入 1. 5 ml 250 µg / L S2251（用 0. 1 mol/ L Tris- HCl ， pH7. 4 溶解） ， 其中在一个杯中加入 155 µl pH7. 4 的 0. 1 mol/ L Tris-HCl 混匀用作空白对照， 另一个杯注入 1 mg/ ml 溶 栓素 155 µl 立即混匀并计时， 于 405 nm 处测光吸收值的变化， 每隔 30 s 读数一次， 共30 min， 至底物反应完全。取前5 min 所 得到的数值作出时间-光吸收关系曲线， 计算出相关系数即每 min 光吸收的变化值， 纯化前后样品各重复上述过程 3 次。以 生成 1 µmol/ min 酶活力定义一个单位， 按以下公式计算：溶栓 素活力单位 （µmol/ min）= A405·U/ ·L， 式中 A405为每分钟 光吸收的变化值， U 为酶促反应体积 （1. 655 ml） ， 为硝基苯胺 的消光系数 10 500 mol -1·L-1·cm-14， L 为光比色杯光程长 度。酶的比活力即每 mg 蛋白的酶活力， 按以下公式进行计算： 溶栓素的比活力 （µmol·min -1·mg-1蛋白）= 溶栓素活力单 位/ 测定所用的酶量。 1. 2. 3 溶栓素纯度的检测 5 应用 HPLC 技术， 采用 Aglient Zorbax SB-C18 柱， 柱温 40 0. 39 mg/ ml 提纯前 （0. 47 mg/ ml 提纯后） 样品上样 10 µl， 流动相 A 为 0. 05% TFA、 流动相 B 为 含0. 05%TFA 的乙腈， 25 min 线性梯度40% 100%B 洗脱， 流 速 1 ml/ min， 30 min 结束。波长 215 nm 检测。 1. 3 统计学处理 用 SPSS13. 0 软件包建立数据库并进行处 理分析， 数据以 x ± s 表示， 进行 t 检验。 2 结 果 2. 1 溶栓素比活力大小的检测 溶栓素比活力大小纯化前后 分别为 （0. 20 ± 0. 06） 和 （0. 20 ± 0. 11）µmol·min -1·mg-1蛋 白， 溶栓素样品纯化前后比活力大小比较并无明显的变化 （P 0. 05） 。 图 1 提纯前后的样品 2. 2 溶栓素纯度的检测 经过 HPLC 可见纯化前样品总峰面 积为729. 926 mAU × s， 除了主峰溶栓素还有3 个杂质小峰。溶 栓素的保留时间为 1. 129 min，其峰面积为 697. 67 mAU × s， 占 总面积的 95. 58%； 保留时间为 1. 236 min 的杂质峰面积为 16. 17 mAU × s， 占总面积的 2. 22%； 保留时间为 1. 503 min 的 杂质峰面积为 11. 48 mAU × s， 占总面积的 1. 57%； 保留时间为 0. 099 min 的杂质峰面积为 4. 61 mAU × s， 占总面积的 0. 63%。 纯化后溶栓素的峰面积 838. 95 mAU × s， 占总面积的 97. 57%； 保留时间为 1. 235 和 1. 501 min 的杂质峰面积则分别为 12. 87 和 8. 033 mAU × s， 下降至 1. 53% 和 0. 90%， 而保留时间为 0. 099 的杂质已经基本除尽。见图 1。 3 讨 论 溶栓素是本教研室从一种海洋生物体内提取出来的具有 良好溶解血栓能力的蛋白酶。经过 HPLC 测定其纯度高达 95. 58%， 经动物实验证明， 在溶栓治疗上有良好的应用前景， 但是对于其本身的理化性质还知之甚少。 为了获得酶本身的生物学特性， 首先应将其纯化至同质状 态。酶学专家 Racker 说：“在酶的研究过程中， 始终要考虑酶 本身的纯净问题” 6。对于酶的纯化来说， 保持酶的活性很重 要。对于大多数蛋白质来说， 在低温、 中性的缓冲液中进行操 作是不变性的。根据以往的研究结果， 溶栓素的 pI 为 4. 5 7， 最适 pH 为 7. 8， 且在 pH4. 0 9. 0 范围内其活性变化很小 8， 所以我们的电泳缓冲体系采用 pH8. 9， 从而在尽量保持其活性 的同时， 使其分离速度达到最大。在整个纯化过程中， 我们始 终使溶栓素处于 3 4 条件下。这样， 我们在温度和酸碱度 方面都给予了充分考虑。通过比活性的测定我们发现纯化后 溶栓素的活性并未受到影响。通过纯度检测， 其纯度提高了 2 个百分点。整个纯化过程并不需要过多的高级实验仪器。整 个实验流程可以为其他实验室酶纯化提供参考依据。 通过比活性和纯度的检测， 本实验过程还是切实可靠的。 经其制备的样品可以用于以后的溶栓素的生物学性质研究。 4 参考文献 1 汪家政， 范 明 . 蛋白质技术手册 M . 北京： 科学出版社， 2000： 77-123. 2 郭尧君 . 蛋白质电泳实验技术 M . 北京： 科学出版社， 1999： 254- 8. 3 Walker J M. New protein techniques M . UK： Humana Press， 1988： 25- 32. 4 Nieuwenhuizen W，Voskuilen M，Vermond A，et al. The influence of fi- brin （ogen）fragments on the kinetic parameters of the tissue-type plas- minogen-activator- mediated activation of different forms of plasminogen J . Eur J Biochem， 1988； 174： 163-9. 5 Cutler P. Protein purification protocolsM . 2nd ed. . New Jersey：Hu- mana Press， 2003： 282-95. 6 Copeland RA. Enzymes：a practical introduction to structure，mecha- nism，and data analysisM . 2nd ed. New York：Wiley-VCH，Inc， 2002： 1-10. 7 张云龙， 崔佳乐， 付海英， 等 . 溶栓素的分离纯化及特性测定 J . 中 国生化药物杂志， 2005； 26 （1） ： 18-21. 8 程 熠， 张家颖， 王之光， 等 . 溶栓素的性质及生物活性研究 J . 白 求恩医科大学学报， 2001； 25 （5） ： 470-1. 2005-06-22 收稿 2005-08-22 修回 （编辑 张 慧） ·3051·王 昭等 溶栓素样品精纯方法的研究 第 12 期