卡托普利对大鼠肺纤维化及肺上皮细胞凋亡的影响.pdf

第 15 卷第 3 期 2005 年 6 月 江 苏 大 学 学 报 （医 学 版） Journal of Jiangsu University （medicine） Vol. 15No. 3 Jun. 2005 卡托普利对大鼠肺纤维化及肺上皮细胞凋亡的影响 夏齐樽，殷凯生 （南京医科大学第一附属医院呼吸科，江苏 南京 210029） 摘 要 目的：探讨卡托普利对实验大鼠肺纤维化的干预作用及可能的作用机制。方法：60 只 SD 大鼠经气管内 灌注博来霉素诱导肺纤维化， 随机分为博莱霉素 （BLM） 组、 卡托普利 （CAP1） 和 CAP2 组， 分别给予生理盐水、 卡托普 利 50 mg·kg -1·d-1和 60 mg·kg-1·d-1灌胃， 并于 1， 7， 14， 28 d 各处死 5 只， 取肺组织行嗜伊红染色组织学观察及 羟脯氨酸测定， 评价肺泡炎和肺纤维化程度、 免疫组织化学及电镜检查评价肺上皮细胞凋亡程度。结果：与 BLM 组 比较 CAP1 组和 CAP2 组肺泡炎及肺纤维化程度明显减轻 （P 0. 05） ， 气道上皮细胞和肺泡上皮细胞凋亡程度显著改 善 （P 0. 01） ， CAP1 和 CAP2 两组间无显著性差异。结论：卡托普利能有效抑制博来霉素诱导的肺纤维化， 其可能的 抗纤维化机制之一是抑制肺上皮细胞凋亡。 关键词 卡托普利；凋亡；肺纤维化；肺上皮细胞 中图分类号 R -33 文献标识码 A 文章编号 1671 -7783 （2005） 03 -0198 -03 Effects of Captopril on Pulmonary Fibrosis and Apoptosis of Pulmonary Epithelial Cells in Rats XIA Qi-zun， YIN Kai-sheng （Department of Respiratory， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China） Abstract Objective：To investigate the effects of captopril on the development of pulmonary fibrosis and the possible underlying mechanisms. Methods： Pulmonary fibrosis was induced with intratracheal infu- sion of blemycin in 60 rats. These rats were divided into BLM group which was treated with saline，CAP 1 and CAP2 groups which were administered with captopril at doses of 50mg/ kg and 60mg/ kg per day respec- tively. On 1， 7， 14， and 28 days after bleomycin treatment， 5 rats in each group were killed and the lungs were harvested. The degree of pulmonary fibrosis was evaluated by histology and detection of hydroxypro- line. The apoptosis in lung epithelial cells was detected using in situ terminal Deoxynucleotidyl dUTP nick - end labeling （TUNEL）and electron microscopy. Results：The degree of pulmonary fibrosis decreased significantly and apoptosis of lung epithelial cells was markedly improved in CAP group as compared with BLM group （P 0. 05） . Conclusion：Captopril can attenuate bleomycin-induced pulmonary fibrosis and its possible mechanism is inhibiting apoptosis of lung epithelial cells. Key words Captopril ； Apoptosis； Lung epipthelial cells；Pulmonary fibrosis 肺纤维化是由多种原因引起的严重肺部疾病， 其发病机制尚未完全阐明， 也缺乏有效的治疗方法。 越来越多的研究表明肺组织中存在局部内源性肾素 血管紧张素系统 （renin-angiotensin system， RAS） 1， 该系统中的主要效应因子血管紧张素 （angiotensin ， ANG） 通过诱导肺上皮细胞凋亡等多种机制 参与了肺纤维化的发生和发展。因此， 通过血管紧 张素转化酶抑制剂 （angiotensin-converting enzyme， ACE） 或 ANG受体拮抗剂阻断 ANG的致纤维化 作用可能为肺纤维化的治疗提供新的手段。本实验 研究卡托普利对肺纤维化及肺上皮细胞凋亡的影响 以探讨其抗纤维化作用及其可能的机制。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 SD 大鼠购自南京医科大学动物实验中心。 作者简介夏齐樽 （1963 - ） ， 男， 安徽马鞍山人， 硕士研究生； 殷凯生 （联系人） ， 教授， 博士生导师， yinks126. com。 1. 2 主要试剂及仪器 博来霉素系日本化药株式会社产品。卡特普利 为上海华氏制药有限公司产品。羟脯氨酸 （HYP） 测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TUNEL 试剂 盒 购 自 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司。 JEM1010 型透射电镜观察凋亡细胞形态。 1. 3 动物模型的建立与标本处理 SD 雄性大鼠 60 只， 体重 180 220 g， 随机平均 分为3 组： 博来霉素组 （BLM） 、 卡托普利 1 （CAP1） 和 卡托普利 2 （CAP2） 组。以 1% 的戊巴比妥钠 （0. 4 ml/100g） 腹腔内注射麻醉动物后， 经颈正中切口分离 气管， 按5 mg·kg -1气管内注入博来霉素制作肺纤维 化模型。CAP1 和 CAP2 于博来霉素处理前 2 天开始 灌胃给药 （剂量分别为 50 mg·kg -1. d-1和 60 mg· kg -1·d-1） 。两组动物于第 1、 7、 14、 28 天各组随机 处死5 只， 分离肺组织， 取右中叶肺置于4%多聚甲醛 中固定制备石蜡切片供组织学检查 （HE 染色） 及 TUNEL 检测。取左肺置于 -70冰箱行 HYP 统一测 定。迅速于右下肺钳取多块 1 mm 左右薄片， 置于 3%的戊二醛溶液中， 按电镜常规进行标本制备。 1. 4 观察指标 1. 4. 1 肺泡炎和肺纤维化程度 HE 染色光镜观 察肺泡炎和肺纤维化程度， 按 Szapiel 等 2法评价肺 组织病理变化严重程度。 1. 4. 2 肺组织 HYP 测定 按试剂盒说明书用样本 碱水解法行肺组织 HYP 测定。 1.4. 3 肺上皮细胞凋亡检测 按说明书操作进行 TUNEL 法凋亡细胞半定量， 用凋亡指数反映凋亡的 严重程度 3。透射电镜观察凋亡细胞形态4。 1. 5 统计学处理 数据以均数 ± 标准差 （-x ± s） 表示。计量资料采 用 t 检验， 等级计数资料转化为计量资料， 方法为： 0 级计 0 分， 1 级计 1 分， 依此类推， 然后行 t 检验。采 用 SPSS11. 0 统计软件进行数据处理。 2 结 果 2. 1 光镜下肺组织病理变化 BLM 组第 1 天开始肺泡腔内见巨噬细胞、 中性 粒细胞和淋巴细胞渗出， 表明出现肺泡炎。第 7 天 有成纤维细胞增殖， 病灶内肺泡萎陷。第 14 天肺泡 炎减轻， 肺泡壁增厚， 纤维组织增生。第 28 天肺纤 维化程度加重伴肺泡结构破坏 （见图 1） 。与之相 比， CAP1 和 CAP2 组第 14、 28 天肺泡炎明显减轻， 第 28 天肺纤维化程度显著缓解 （见图 2） ， 而 CAP1 和 CAP2 两组间各时间点肺泡炎和肺纤维化程度无 显著性差异 （见表 1） 。 表 1 实验大鼠肺泡炎、 肺纤维化程度的比较 - x ±s 组别n 肺泡炎程度 1 d7 d14 d28 d 肺纤维化程度 1 d7 d14 d28 d BLM 组202. 1 ±0. 33. 2 ±0. 33. 0 ±0. 33. 1 ±0. 21. 4 ±0. 42. 1 ±0. 32. 9 ±0. 43. 2 ±0. 6 CAP1 组202. 4 ±0. 52. 7 ±0. 32. 4 ±0. 3*2. 2 ±0. 4*1. 2 ±0. 31. 9 ±0. 42. 7 ±0. 42. 2 ±0. 4* CAP2 组202. 1 ±0. 42. 5 ±0. 42. 2 ±0. 42. 0 ±0. 31. 4 ±0. 41. 6 ±0. 32. 6 ±0. 62. 3 ±0. 4 CAP1 组与 BLM 组比较， *： P 0.05 （t 值分别为 3.207、 4.243、 2. 683， P 值分别为 0. 012、 0. 030 和 0. 028） ； ： CAP2 组与 BLM 组比 较 P 0. 05 （t 值分别为 3.057、 2.764、 4.183， P 值分别为 0.016、 0.025 和 0. 030） 2. 2 肺组织 HYP 含量变化 BLM 组 HYP 含量随造模时间的延长逐渐增 加， 说明肺组织内胶原合成逐渐增多， 肺纤维化程度 逐渐加重； 进行性发展至第28 天组达高峰， 而 CAP1 和 CAP2 组第14、 28 天 HYP 含量显著低于 BLM 组。 CAP1 和 CAP2 两组间各时间点 HYP 含量无显著性 差异 （见表 2） 。 表 2 肺组织 HYP 含量分析µg/ g 湿重 组别n1 d7 d14 d28 d BLM 组20612. 2 ±38. 3683. 1 ±41. 6904. 5 ±49. 2 1001. 1 ±109. 5 CAP1 组20596. 1 ±23. 427. 3 ±52. 5682. 1 ±37. 7*766. 3 ±38. 6* CAP2 组20581. 3 ±20. 5652. 7 ±90. 5662. 1 ±52. 7736. 6 ±32. 5 CAP1 组与 BLM 组比较*： P 0.05 （t 值分别为8.020、 4.521， P 值分别为0. 000 和0. 002） ； ： CAP2 组与 BLM 组比较 P 0. 05 （t 值 分别为 7. 514、 5.177， P 值分别为 0.000 和 0.001） 991第 3 期 夏齐樽等：卡托普利对大鼠肺纤维化及肺上皮细胞凋亡的影响 2. 3 肺泡上皮细胞和气道上皮细胞凋亡改变 BLM 组 第 1 天 开 始 细 支 气 管 壁 见 棕 色 TUNEL 阳性凋亡气道上皮细胞核。棕色肺泡上 皮细胞核呈局灶性分布， 主要见于呼吸性细支气 管、 肺泡管和小血管附近。第 7、 14、 28 天， 气道上 皮细胞凋亡加重， 凋亡肺泡上皮细胞广泛分布于 肺实质， 但以肺纤维化区域更为严重 （见图 3） 。 CAP1 和 CAP2 组第 1 28 天肺泡上皮细胞和气 道上皮细胞凋亡程度显著轻于 BLM 组 （见表 3， 图 4） 。 表 3 肺泡上皮细胞及气道上皮细胞凋亡指数分析 组别n 肺泡上皮细胞凋亡指数 1 d7 d14 d28 d 气道上皮细胞凋亡指数 1 d7 d14 d28 d BLM 组2022. 4 ±3. 526. 2 ±3. 228. 8 ±2. 528. 2 ±2. 426. 4 ±4. 040. 1 ±3. 642. 3 ±4. 938. 1 ±4. 3 CAP1 组207. 2 ±0. 9*6. 9 ±0. 6*7. 7 ±0. 7*7. 6 ±0. 5*17. 4 ±1. 5*16. 6 ±1. 4*18. 4 ±1. 3*13. 2 ±1. 1* CAP2 组206. 8 ±0. 97. 6 ±0. 68. 6 ±1. 17. 8 ±0. 315. 2 ±1. 416. 2 ±0. 620. 4 ±1. 212. 4 ±0. 9 CAP1 组与 BLM 组比较*： P 0.05 （t 值分别为 9.385、 13.169、 17. 989、 18. 544、 4. 767、 13. 575、 10. 177 和 12. 588， P 值皆为 0. 000） ； ： CAP2 组与 BLM 组比较 P 0.05 （t 值分别为 9.614、 12.580、 16.283、 18. 638、 5. 421、 14. 686、 9. 690 和 13. 101， P 值皆为 0. 000） 。 2. 4 透射电镜下形态学改变 BLM 组第 1 28 天均见凋亡型肺泡上皮细 胞和气道上皮细胞， 表现为核固缩， 细胞染色质边聚 明显， 核膜表面凹凸不平； 还可见较明显的核膜断 裂， 胞质浓缩、 减少更为明显， 并可见大量电子密度 高的核碎片、 空泡， 线粒体变圆， 空泡化。第 14、 28 天肺泡间质胶原明显多于相应时间的 CAP1 和 CAP2 组。 3 讨 论 肺纤维化的发病机制复杂， 至今尚未完全阐明。 传统观点认为， 慢性炎症是成纤维细胞增殖和肺部 结构改变的主要因素， 但近来大量研究显示肺纤维 化过程起始于肺泡， 肺泡上皮细胞凋亡在肺炎症/ 肺 纤维化的发生与发展中可能起非常重要的作用。此 外， 目前认为 RAS 可以完整独立地存在于局部组 织， 具有自分泌或旁分泌功能， 与细胞生长及组织纤 维化有密切的关系。在肺局部内源性 RAS 中， 其主 要效应因子 ANG在特定的条件下能直接刺激成 纤维细胞生长及胶原分泌， 诱导内皮细胞和上皮细 胞凋亡， 调节多种细胞因子和生长因子潜在地影响 成纤维细胞/ 平滑肌细胞及上皮细胞/ 内皮细胞间的 生长平衡等多种机制参与了肺纤维化的发生和发 展 5。这为肺纤维化的治疗提供了一个切入点， 即 用 ACE 抑制剂或 ANG受体拮抗剂阻断 ANG的 上述效应从而达到治疗肺纤维化的目的。本实验研 究结果显示 CAP1 组和 CAP2 组肺泡炎、 肺纤维化程 度及 HYP 含量显著低于 BLM 组， 表明 ACE 抑制剂 卡托普利对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化有显著的 保护作用， 提示该类药物单独使用或和其他药物联 合应用可能为肺纤维化的治疗提供新手段。 对肺损伤动物模型和肺纤维化患者肺活检的大 量研究表明间质纤维化的发生与肺泡上皮细胞不完 全修复密切相关。肺泡上皮细胞除了提供完整的屏 障功能， 还是 PGE2合成的主要细胞， 而 PGE2是成 纤维细胞增殖的抑制剂； 此外正常肺泡上皮细胞还 能产生尿激酶型凝血酶原激活物， 具有降解肺泡腔 内纤维蛋白凝块的潜力。细胞凋亡是肺泡上皮细胞 数量调节的重要方式， 并且是肺纤维化的重要特征。 凋亡所致的肺泡上皮细胞的丧失削弱了上述抗纤维 化功能， 有助于肺纤维化的发生。功能性 Fas 表达 于肺泡上皮细胞； 表达 Fas 配体的淋巴细胞介导了 博来霉素诱导的肺泡上皮细胞凋亡； 气管内给予 Fas 激活抗体能诱导大鼠肺纤维化 6。这些资料表 明 Fas 诱导的肺泡上皮细胞凋亡是肺纤维化发生的 重要组成部分。本实验结果显示在博来霉素诱导的 肺纤维化模型中， 存在肺上皮细胞凋亡， 并且肺纤维 化区域凋亡程度更重， 提示肺上皮细胞凋亡有助于 肺纤维化的形成。此外， ACE 抑制剂卡托普利能显 著抑制博来霉素诱导的肺上皮细胞凋亡并减轻肺纤 维化程度， 表明抑制肺上皮细胞凋亡可能是卡托普 利潜在的抗纤维化机制之一。 RAS 的主要功能是对血压和体液自稳状态的 调节， ACE 抑制剂或 ANG受体拮抗剂的使用会对 血流动力学产生不利影响， 因此兼顾抗纤维化作用 和血流动力学影响的合适剂量相当重要。本实验结 果表明50 mg·kg -1·d-1的卡托普利即可显著缓解 （下转第 204 页） 002 江 苏 大 学 学 报 （医学版） 第 15 卷 3 讨 论 3. 1 不同有机溶剂对同一细胞株具有不同的细胞 毒性 在所研究的 6 种有机溶剂中， 丙酮对三种肿瘤 供试细胞株毒性最弱， 在体积分数为 10% 时也没有 明显的细胞毒性； 其次甲醇的毒性较弱， 在体积分数 1% 时没有明显的细胞毒性， 所以在以 U937 细 胞、 95D 细胞和 AGS 细胞为研究对象时， 建议使用 丙酮和甲醇作为弱极性待试药品的溶剂。 3. 2 同一种有机溶剂对不同细胞株具有不同的毒 性 乙醇对 U937 细胞的毒性在 1% 体积分数时没 有明显的毒性， 对 95D 细胞在 0. 3% 体积分数时没 有明显的毒性， 对 AGS 细胞在 0. 1% 时已经表现出 明显的细胞毒性； 甲醇对 U937 细胞和 AGS 细胞的毒性在 1% 体 积分数时没有明显的毒性， 对 95D 细胞在 0. 3% 体 积分数时没有明显的毒性， 在 1% 3% 时表现一定 的毒性； 甘油对 U937 细胞 0. 3% 时没有明显的细胞毒 性， 对 95D 细胞在 1%体积分数时没有明显的毒性， 对 AGS 细胞在体积分数 0. 1% 时没有明显的毒 性； 异丙醇对 U937 细胞在体积分数 3% 时没有 明显的细胞毒性， 对 95D 细胞在 0. 1% 体积分数时 就表现出明显的毒性， 对 AGS 细胞在体积分数 0. 3%时没有明显的毒性； DMSO 对 U937 细胞在体积分数 1%时细胞毒 性较弱， 对 95D 细胞在 0. 1% 体积分数时就表现出 明显的毒性， 对 AGS 细胞在体积分数 0. 1% 没有 明显的细胞毒性。 试验研究的结果与纪舒昱等 1研究的结果有 较大的不同， 纪舒昱等认为甲醇的细胞毒性较小， 而 丙酮的细胞毒性较大。分析原因， 可能是试验所选 的细胞株不同， 而同一种有机溶剂对不同的细胞株 表现的毒性不同。所以对于弱极性的试验样品， 在 选择试验肿瘤细胞株后， 有必要进行有机溶剂毒性 的试验， 然后选择合适的有机溶剂。 参考文献 1 纪舒昱， 翁稚颖， 周轶平， 等. 8 种有机溶剂对肿瘤细胞 的细胞毒作用 J . 云南大学学报 （自然科学版） ， 2001， 23 （6） ： 457 -460. 2 徐叔云， 卞如濂， 陈 修. 药理实验方法学 M . 第 3 版. 北京： 人民卫生出版社， 2002. 1784. 3 韩 锐. 抗癌药物研究与实验技术 M . 北京医科大 学中国协和医科大学联合出版社， 1997. 2. 收稿日期 2004 -11 -05 （上接第 200 页） BLM 诱导的肺纤维化， 与 60 mg·kg -1·d-1剂量并 无显著性差异， 但其量 - 效关系有待于进一步研究。 总之， ACE 抑制剂卡托普利能有效抑制博来霉素诱 导的肺纤维化， 其可能的抗纤维化机制之一是抑制 肺上皮细胞凋亡。 （本文图 1 4 见插图 3） 参考文献 1 Alan F， Rebecca P， Stephen G， et al. Apoptosis in lung pathophysiology J . Am J Physiol Lung CellMol Physiol， 2000， 279： 423 -427. 2 Szapiel SV， Elson NA. Bleomycin-induced interstitial pul- monary fibrosis in the nude， athymic mouse J . Am Rev Respir Dis， 1979， 120： 893. 3 Rongqi W， Olivia IS， Luba V， et al. Abrogation of bleomy- cin-induced epithelial apoptosis and lung fibrosis by cap- topril or a caspase inhibitor J . Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2000， 279： 143 -151. 4 彭黎明. 六种细胞凋亡检测方法比较 J . 中华病理学 杂志， 1999， 28： 55 -57. 5 Wang R， Zagariya O， Ibarra-Sunga C， et al. Angiotensin induces apoptosis in human and rat alveolar epithelial cells J . Am J Physiol， 1999， 276： 885 -889. 6 Bruce D， Uhal BD. Apoptosis in lung fibrosis and repair J . Chest， 2002， 122： 293 -298. 收稿日期 2004 -03 -23 402 江 苏 大 学 学 报 （医学版） 第 15 卷