地塞米松对大鼠肝脏MRP2和AQP1表达的影响.pdf

·1 6 0 0 · 地塞米松对大鼠肝脏M r p 2 和A Q P l 表达的影响 夏诺评 ( 湖南省益阳市人民医院消化内科，湖南益阳4 1 3 0 0 0 ) 摘要 【目的】探讨地塞米松( D e x ) 对W i s t a r 大鼠肝胆系统多药耐药相关蛋白2 ( M r p 2 ) 和水通道蛋白1 ( A Q P l ) 的调节作用。【方法 2 0 只W i s t a r 大鼠随机分为空白对照组和D e x 干预组，观测1h 胆汁流量、直接 胆红素( D B I L ) ，用免疫组织化学的方法观测M r p 2 和A Q P l 的表达。【结果】干预组较之对照组胆汁量增加 ( P 0 0 5 ) ，M r p 2 和A Q P l 免疫组 化切片光密度值增加( P 0 0 5 ) T h eo p t i c s ld e n s i t yv a l u eo fM r p 2a n dA Q P li n c r e a s e d ( P O 0 5 ) ( 表1 ) 。 1 材料与方法 表l 两组胆汁量和血清及胆汁D B l L 的测定结果( ；士，) 1 1 材料健康雄性成年W i s t a r 大鼠2 0 只( 湘雅 医学院实验动物中心提供) ，体重2 0 0 - - 一2 5 0g 。D e x 注射液( 天津药业焦作有限公司生产) ；日节O l y m - p u s 公司全自动生化分析仪A u 6 4 0 ；M r p 2 和A Q P l 试剂盒由深圳晶美公司提供。2 0 只W i s t a r 大鼠随 机分为空白对照组( C c o n t r o l 组) 和地塞米松干预组 ( D e x 干预组) ，每组各1 0 只，于试验4 8h 取标本。 1 2 方法所有大鼠适应性饲养1 周，D e x 干预 大鼠1 5 0m g k g 腹腔皮下注射，对照组同样条件下 饲养至4 8h 。所有大鼠腹腔注射水合氯醛( 4 0 0 m g k g ) 溶液麻醉后，上腹中线附近剖腹，行胆总管插 管，收集胆汁计1h 胆汁量，门静脉取血与胆汁一起 送自动生化仪查直接胆红素( D B I L ) ，切除左叶肝 脏，生理盐水冲洗后，然后迅速切除约1 0 c m ×0 5 c r u x 0 5c m 大小肝脏组织块浸入1 0 的福尔马林 溶液中固定。常规石蜡包埋切片，切片二甲苯脱蜡， 梯度酒精水化。磷酸盐缓冲液( P B S ) 浸洗3 次，每 次2r a i n 。枸橼酸缓冲液( p H6 0 ) 微波修复抗原。 每张切片加1 滴过氧化物酶阻断溶液，阻断内源性 过氧化物酶的活性，室温下孵育1 0m i n 。P B S 洗3 次，每次2r a i n 。甩去P B S 液体，每张切片滴加正常 山羊血清封闭液，室温下孵育2 0m i n 。甩去血清分 别滴加一抗( 兔抗鼠A Q P l 多克隆抗体，滴度为1 ： 2 0 0 。兔抗鼠M r p 2 多克隆抗体，滴度为1 t 1 0 0 ) 4 过夜。P B S 洗3 次，每次2m i n 。滴加二抗通用 型I g G 抗体，室温下孵育1 0m i n 。P B S 洗3 次，每 次2m i n 。每张切片加1 滴链酶菌抗生物素一过氧化 物酶溶液，室温下孵育1 0m i n 。P B S 洗3 次，每次2 m i n 。经0 0 5 二氨基联苯氨( D A B ) 溶液显色3 5m i n ，在显微镜下掌握染色程度。自来水冲洗1 0 m i n 。苏木素复染2r a i n ，盐酸酒精分化。水洗1 0 m i n 。明胶封片，镜检阅片。P B S 代替一抗设为阴 性对照，结果进行图像分析( 国产H P I S A 2 1 0 0 0 0 高 清晰度彩色病理图像免疫组化测量系统) ，测M r p 2 及A Q P l 表达的平均灰度( O D 值) 。 与C o n t r o l 组比较：1 ) P O 0 5 1 2 ) P o 0 1 2 2 两组M r p 2 和A Q P l 表达的变化D e x 干预 组大鼠与空白对照组比较，M r p 2 和A Q P l 的表达 明显加强( P O 0 1 ) ( 表2 ) 。 衰2 两组M r p 2 和A Q P l 的O D 值测定结果( ；±j ) * 与C o n t r o l 组比较：P o 0 1 2 3 A Q P l 与胆汁量。M r p 2 与血清D B I L 变量问 的相关分析A Q P l 的0 D 值与胆汁量的相关系数 是( r = 0 7 8 5 ，P 0 0 1 ) ，提示两者密切正相关。 M r p 2 的o D 值与血清D B I L 的相关系数是( r = 一 0 6 3 5 ，Pd 0 0 1 ) ，提示两者负相关。 3讨论 近年来随着国内外对于肝脏胆汁分泌机制研究 的进展，多种负责转运胆汁各成分的多种转运蛋白 相继发现，功能得到进一步的阐述。其中M r p 2 和 A Q P 因为主要转运胆红素和水分，尤其引人关注。 M r p 2 是三磷酸腺苷( A T P ) 结合盒运载体家族 成员 3 。1 9 9 6 年P a u l u m a 等发现在D u b i n J o h n s o n 综合征( D J S ) T R 一鼠动物模型中的M r p 2 ，并命名为 管状多特异性有机阴离子转运蛋白( M O A T ) 1 。 M r p 2 主要表达在人体肝细胞基底膜上，A k i t a 等 s 证实M r p 2 在肝细胞分泌结合胆红素入胆汁过程中 起重要作用，缺乏M r p 2 基因将引起D u b i n - J o h n s o n 综合征。陈应果 6 证实了M r p 2 是胆红素排泄 的主要转运子1 。肝细胞在地塞米松作用下M r p 2 万方数据 ·1 6 0 2 · 医堂堕鏖煎塞! ! 塑生! 旦箜! ! 鲞筮! 塑g 也墨塑：皇壁：! ! ! ! ：! ! ! ! ：些! 表达上调，胆汁分泌也增多。本实验证实D e x 干预 组M r p 2 表达上调，血清D B I L 下降，两者高度负相 关，提示多量M r p 2 将多量D B I L 转运入胆汁。 A Q P 是2 0 世纪9 0 年代初发现的一类介导自 由水被动跨生物膜转运的小分子膜蛋白。自A g r e 等首先发现A Q P l 以来 7 ，目前已经发现至少1 3 种A Q P ( A Q P o A Q P l 2 ) 8 。在大鼠肝细胞及胆管 细胞有多种A Q P 表达 9 。多个研究表明A Q P 在 肝细胞生成胆汁及胆管排泌修饰胆汁的过程中负责 了绝大多数水的转运【2 。D e x 促进大鼠肝细胞胆汁 分泌，导致肝细胞毛细胆管样结构扩张 I 。在重症 急性胰腺炎( S A P ) 急性肺损伤中，经糖皮质激素干 预后，A Q P l 在肺组织中表达增强，肺损伤减轻¨1 1 。 糖皮质激素能使腹膜毛细血管内皮细胞腔面膜及基 底膜处的A Q P l 表达上调 1 2 1 。本组实验表明在肝 胆系统，D e x 上调A Q P l 的表达，胆汁量增加，两者 正相关。 对包括M r p 2 和A Q P l 在内的多种转运蛋白表 达调控机制的研究是新近的热点。机体内多种核受 体包括组成性雄烷受体，肝X 受体a ，维生素D 受 体，糖皮质素受体等等对肝脏胆汁代谢的调控作用 至为重要 1 引。这些核受体作为转录因子，结合到特 异性配体启动子的反应元件，在转录水平和( 或) 转 录后水平调节胆汁代谢的关键酶和转运体基因，从 而调节体内胆汁各成分的量 1 引。M o o n 等在研究红 白血病细胞时发现，细胞的A Q P l 启动子区域存在 糖皮质激素反应元件( G R E ) 1 5 。L uH 1 6 的研究表 明糖皮质激素受体下调使M r p 2 的表达发生改变。 糖皮质激素可能通过结合于细胞内的糖皮质激素受 体，形成复合物进入细胞核内，作用于核内D N A 的 糖皮质激素反应元件调节基因的表达。针对这一思 路的研究是今后的工作方向。 1 3 2 3 参考文献 陈应果，别平，祝建勇胆红素主要转运子M R P 2 在大鼠梗 阻性黄疸肝脏中的表达及意义 J 第三军医大学学报，2 0 0 4 ， 2 6 ( 1 6 ) ：1 4 2 9 1 4 3 1 M a s y u kA I ，L a R u s s oN F A q u a p o r i n si nt h eh e p a t o b i l i a r y s y s t e m J H e p a t o l o g y 。2 0 0 6 ，4 3 ( 2S u p p l1 ) ：S 7 5 8 1 B o r s tP 。Z e l c e rN ，V a nd eW e t e r i n gK M R P 2a n d3i n h e a l t ha n dd i s e a s e J C a n c e rL e t t ，2 0 0 6 ，2 3 4 ( 1 ) ：5 1 6 1 4 P a u l u s m aC C ，B o s m aP J ，O u d eE l f e r i n kR P ，da 1 C o n g e n i t a Ij a u n d i c ei nr a t sw i t ham u t a t i o ni nam u h i d r u gr e s i s t a n c e - a s s o c i a t e dp r o t e i ng e n e J S c i e n c e ，1 9 9 5 。2 7 1 ( 5 2 5 2 ) ：1 1 2 6 1 1 2 8 5 A k i t aH ，S u z u k iH ，I t oK ，da 1 C h a r a c t e r i z a t i o no fb i l ea c i d t r a n s p o r tm e d i a t e db ym u h i d r u gr e s i s t a n c ea s s o c i a t e dp r o t e i n 2a n db i l es a l te x p o r tp u m p J B i o c h i mB i o p h y sA c t a ， 2 0 0 1 。1 5 1 1 ( 1 ) 1 7 - 1 6 E 6 3 刘磊，邓敏，高人焘等几种药物对H e p G 2 细胞M R P 2 表达 的影响I S 实用肝脏病杂志，2 0 0 6 ，9 ( 6 ) ：3 3 3 - 3 3 6 7 P r e s t o nG M ，C a r r o l lT P ，G u g g i n oW B ，西a 1 A p p e a r a n c eo f w a t e rc h a n n e l si nX e n o p u so o c y t e s e x p r e s s i n gr e dc e l l C H I P 2 8p r o t e i n J S c i e n c e 。1 9 9 2 ，2 5 6 t3 8 5 3 8 7 8 3 M a g n iF ，S a r t oC ，T i c o z z iD ，e ta 1 P r o t e o m i ck n o w l e d g eo f h u m a na q u a p o r i n s J P r o t e o m i c s ，2 0 0 6 ，6 ( 2 0 ) ：5 6 3 7 5 6 4 9 9 H u e b e r tR C ，S p l i n t e rP L ，G a r c i aF ，e ta 1 E x p r e s s i o na n d l o c a l i z a t i o no fa q u a p o r i nw a t e rc h a n n e l si nr a th e p a t o c y t e s E v i d e n c ef o rar o l e i ne a ? a | ! l i c u l a rb i l es e c r e t i o n J 1B i o l C ，2 0 0 2 ，2 7 7 ：2 2 7 1 0 2 27 17 1 0 王贵民，壬忠毅，谭毓铨地塞米松对单层培养的大鼠肝细胞 分泌机能的影响 J 。中华肝胆外科杂志，2 0 0 3 ，9 ( 8 ) ：4 9 5 4 9 8 1 1 王贵民。所剑，王忠义，等地髫来松对重症胰腺炎急性肺损伤 时水通道蛋白表达的影响 J 中华普通外科杂志，2 0 0 7 ，2 2 ( 2 ) ：1 5 7 - 1 5 8 1 2 S t o e n o i u M S ，N iJ ，V e r k a e r e nC ，e ta 1 C o r t i c o s t e r o i d si n d u c ee x p r e s s i o no fa q u a p o r i n - 1a n di n c r e a s et r a n s c e l l u l a r w a t e r t r a n s p o r ti nr a tp e r i t o n e u m J JA mS c oN e p h r o l ，2 0 0 3 ， 1 4 ( 3 ) ：5 5 5 5 6 5 1 3 g o l l n e rG ，M a r s c h a l lH U ，W a g n e rM ·e ta 1 R o l eo fn u c l e a r r e c e p t o r si nt h ea d a p t i v er e s p o n s et ob i l ea c i d sa n dc h o l e s t a s i s ：p a t h o g e n e t i ca n dt h e r a p e u t i cc o n s i d e r a t i o n s J M o l P h a r m ，2 0 0 6 。3 ( 3 ) ：2 3 1 - 2 5 1 1 4 A n w e rM S C e l l u l a rr e g u l a t i o no fh e p a t i cb i l ea c i dt r a n s p o r t i nh e a l t ha n dc h o l e s t a s i s J H e p a t o l o g y ，2 0 0 4 ，3 9 ( 3 ) ：5 8 1 5 9 0 1 5 M o o nC ，K i n gL S ，A g r eP A q p le x p r e s s i o ni ne r y t h r o e u k e m i ac e l l s ：g e n e t i cr e g u l a t i o no fg l u c o c o r t i c o i da n dc h e m i c a li n d u c t i o n J A mJP h y s i o l ，1 9 9 7 ，2 7 3 ( 5P t1 ) ：C 1 5 6 2 一 1 5 7 0 1 6 L uH ，K l a a s s e nCG e n d e rd i f f e r e n c e si nm R N Ae x p r e s s i o n o fA T P - b i n d i n gc a s s e t t ee f f l u xa n db i l ea c i dt r a n s p o r t e r si n k i d n e y ，l i v e r ·a n di n t e s t i n eo f5 6n e p h r e c t o m h e dr a t s E J D r u gM e t a bD i s p o s ，2 0 0 8 ·3 6 ( 1 ) 1 1 6 2 3 ( 本文编辑：葛志庆) 收稿日期 2 0 0 8 0 4 1 3 万方数据