白细胞介素8在人乳腺癌细胞侵袭和增殖中的作用.pdf

书书书 ·普通外科基础研究· 作者单位： 510080 广州， 中山大学附属第一医院乳腺病诊治中 心 （林颖、 王深明、 吕伟明） ； 美国亚特兰大 Emory 大学 （黄若磐） 通讯作者： 王深明， Email：shenmingwang sohu. com 白细胞介素 8 在人乳腺癌细胞侵袭和 增殖中的作用 林颖 王深明 吕伟明 黄若磐 【摘要】 目的 探讨白细胞介素 8 （IL-8） 在乳腺癌细胞侵袭和增殖中的作用。方法 运用细 胞因子抗体芯片技术分析 11 株人类乳腺癌细胞的细胞因子表达谱， 研究细胞因子在乳腺癌进展中的 作用机制。结果 细胞因子表达谱显示 IL-8 的表达水平与乳腺癌细胞雌激素受体状态， 转移能力和 波形丝蛋白的状态均相关， 与人类乳腺癌细胞的侵袭直接正相关。IL-8 抗体可以特异性地阻断 IL-8 介导的细胞侵袭作用， 但对乳腺癌细胞增殖无明显作用。结论 IL-8 可能是乳腺癌进展和细胞侵袭 中的关键因子， 在乳腺癌细胞侵袭中起重要作用。 【关键词】 乳腺肿瘤； 白细胞介素 8； 细胞因子； 蛋白质芯片 Effect of interleukin-8 in cell invasion and proliferation of human breast cancer LIN Ying*，WANG Shen-ming，LÜ Wei-ming，HUANG Ruo-pan. *Center of Breast Disease，the First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China Corresponding author：WANG Shen-ming，Email：shenmingwangM sohu. Nom 【Abstract】 Objective To identify the effect of interleukin-8 in cell progression and invasion of human breast cancer. Methods Human cytokine antibody arrays were applied to screen a panel of cytokine expression from 11 human breast cancer cell lines，and the mechanism of identified key factors involved in breast cancer progression was studied. Results Profiling of cytokine expression showed the expression of interleukin-8 was related to estrogen recepter status，metastasis and vimentin status in the 11 human breast cancer cell lines. Elevated expression of interleukin-8 in breast cancer cells had positive correlation with breast cancer invasion. Neutralization of antibody against interleukin-8 specifically blocked interleukin-8- mediated cell invasion. However， anti-interleukin-8 antibody did not influence the proliferation of breast cancer cells. Conclusion Interleukin-8 may be the key factor involved in human breast cancer progression and invasion，and play an important role in cell invasion of breast cancer. 【Key words】 Breast neoplasms； Interleukin-8； Cytokine； Protein arrays 乳腺癌的发展是一个非常复杂的过程。每个个 体的肿瘤病理学特征存在差异， 临床上病灶对治疗 的反应也呈现多样性， 以致预后各不相同。细胞的 信号传导及调节系统在细胞本身及环境之间调控信 息， 从而控制各种靶因子的表达水平， 后者进一步影 响乳腺癌的生物学特性。本研究采用蛋白质芯片技 术进行乳腺癌细胞的细胞因子表达水平检测， 以期 发现与乳腺癌进展相关的机制。 材料与方法 1. 细胞培养及细胞培养上清液收集： 人乳腺癌 细胞在 Dulbecco's modified Eagle's medium （DMEM） 培养液中单层贴壁培养， 培养液内含 10% 胎牛血清 （fetal calf serum， FCS） 。培养条件： 5% CO2、 37、 95%湿度。细胞按 1 × 106个细胞/ 盘密度培养于 100 mm 的细胞培养盘内， 在含有 10% FCS 的 DMEM 培养液 8 ml 中增殖 48 h 后， 更换为含有 0. 2%牛血清的 DMEM 培养液 8 ml。48 h 后， 收集 细胞上清液， 离心 1000 × g 去除细胞碎片， 分装并 储存于 -80。同时， 收集细胞并测定蛋白质浓度， 实验时根据细胞蛋白质浓度标化细胞上清液。 2. 细胞因子抗体芯片： 实验所用的 35 种细胞因 子购自美国 R&D Systems 或美国 BD PharMingen。 将细胞因子抗体芯片膜在 5% 牛血清白蛋白/ TBS （0. 01 mol/ L Tris HCL pH7. 6， 0. 15 mol/ L NaCl） 封 闭非特异性位点 1 h。芯片膜在 1 ml 细胞培养上清 ·1451·中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 图 1 细胞因子抗体芯片检测 35 种细胞因子在 11 种人类乳腺癌细胞中的表达 液中孵育1. 5 h， 不同细胞培养上清液根据收集的细 胞的蛋白质浓度进行标化。经过 0. 1% Tween20/ TBS（3 次， 每次 5 min） 和 TBS （2 次， 每次 5 min） 震 荡洗涤后， 将芯片膜与生物素标记的多种细胞因子 抗体混合液孵育 1. 5 h。再次洗涤， 将芯片膜与 2. 5 pg/ ml 链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶孵育 1 h。 最后采用增强化学发光系统 （amersham pharmacia Biotech， 英国） 显色检测信号 1。通过酶联免疫吸 附试验验证细胞因子抗体芯片实验所得的相对信号 强度。信号强度经过扫描后由密度测量分析仪 （Bio-Rad，美国） 进行定量分析。 3. 重组基底膜侵袭实验： 细胞体外侵袭能力的 测定 在 重 建 基 底 膜 的 12 孔 板 Transwell 小 室 （Corning Costa， 美 国）中 进 行。 Matrigel （ BD PharMingen，美国）30 µl 用不含血清的 DMEM 培 养基 1: 1 稀释 （总量 60 µl） ， 加入 Transwell 小室的 多孔聚碳酯膜上表面 （膜孔径 12. 0 µm） ， 室温下通 风橱中干燥 1 h。将不同细胞株的细胞用磷酸缓冲 液 （phosphate buffer solution，PBS） 洗3 次， 消化后重 悬于含 10% FCS 的 DMEM 培养基中， 取 4 × 105/ ml 细胞 0. 5 ml 加入至上室， 1. 5 ml 10% FCS 的 DMEM 培养基加入下室。37、 5% CO2条件下培养 24 h， 4%甲醛固定后行姬姆萨染色。去除滤膜上层细胞， 显微镜下 （ ×320） 计数滤膜下表面的侵袭了基底膜 的细胞数， 随机计数 5 个视野中的细胞数目， 以侵袭 细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。在培 养基中分别加入阴性对照 PBS、 1 µg/ ml 和 5 µg/ ml 的抗白介素 8 （interleukin 8， IL-8） 中和抗体重复实 验。 4. 细胞增殖实验： 通过噻唑蓝实 验检测乳腺癌细胞增殖速度。利用 非放 射 性 细 胞 梯 度 增 生 试 剂 盒 （Promega，美国） ， 将重悬于不同浓 度小牛血清培养基的 1 ×103个细胞 加入 96 孔板， 培养基中分别加入阴 性对照 PBS、 0. 05 µg/ ml、 0. 5 µg/ ml 和5 µg/ ml 的抗 IL-8 中和抗体， 每个 样本重复三孔。在试验中止时， 用噻 唑蓝处理细胞 4 h， 加入溶解液室温 下过夜， 在 570 mm 波长处读取 A 值。 5. 统计学方法： 统计分析使用 软件 SPSS8. 0 完成。用 t 检验分析 相对信号表达强度， 在 P 0. 05） 。实验中 所使用的细胞株都表达 IL-8 受体， 而外源性的 抗 IL-8 中和抗体并不 能抑制其细胞增殖。 讨论 Yoshimura 等 2和 Walz 等 3几乎同时发 现脂多糖可刺激单核细 胞分泌一种新的前炎症 蛋白 IL-8。IL-8 是第一 个被发现具有化学趋向作用的细胞因子， 能促进白 细胞激活， 在许多生理和病理状态中都发挥重要作 用 4， 5。大量证据表明 IL-8 在肿瘤进展过程中扮演 着极其重要的角色。黑色素瘤细胞分泌大量 IL-8， 并且与肿瘤分裂、 血管生成和转移有直接关系 6。 一系列的实验显示非小细胞肺癌和大肠癌的转移能 力都与 IL-8 的水平呈正相关 7， 8。基因转染研究表 明 IL-8 的表达会促进膀胱癌和前列腺癌转移 9， 10。 既然不同的人类乳腺癌细胞株有独特的表型， 我们假定这种差异与其特殊的细胞因子表达有关。 应用细胞因子抗体制作而成的蛋白质芯片技术检测 了 11 种人类乳腺癌细胞株的 35 种细胞因 子表达水平， 结果显示 IL-8 是人类乳腺癌 细胞进展的重要因子， 与 ER 状态、 转移能 力和波形丝蛋白的状态相关。这项研究有 几个问题值得更深入的探讨。 首先，为了探索 IL-8 在乳腺癌进展中 的作用机制， 我们进行了一系列的试验。 细胞侵袭实验显示人类乳腺癌细胞的侵袭 与 IL-8 水平直接呈正相关， 加入抗 IL-8 中 和抗体以剂量依赖性方式抑制 IL-8 的作 用， 这是支持 IL-8 与人类乳腺癌细胞侵袭 相关的有力证据。根据噻唑蓝实验结果， IL-8 对乳腺癌细胞增殖没有作用。因此， 我们的实验结果提示 IL-8 主要与人类乳 ·3451·中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 腺癌细胞的肿瘤侵袭和转移有关， 而与乳腺癌细胞 增殖没有直接关系。 其次， 细胞因子， 如 IL-8 可能成为人类乳腺癌 的重要生物标记。ER 水平参与决定乳腺癌的临床 分级， 临床上常规检测以判断内分泌治疗的反应， ER 阳性乳腺癌患者比阴性者的预后要好。我们的 研究发现 IL-8 的表达与 ER 阴性乳腺癌细胞中显著 升高， 同时 IL-8 是人类乳腺癌细胞侵袭重要因子。 因此， IL-8 是否在 ER 阴性乳腺癌的肿瘤性状和治 疗反应中起到一定作用引起我们的关注， 并将在下 一步工作中进行研究。 最后， 我们认为蛋白质芯片有希望成为肿瘤进 展研究中寻找靶因子的工具。这项技术为蛋白质差 异表达的筛选开辟了一条新的路径。Van't Veer 等 11利用 cDNA 微阵列技术分析 117 例乳腺癌患 者， 聚类分析得出一组代表预后不良的基因， 以及一 组标识 BRCA1 携带者的基因， 其中包含了调节细胞 周期、 侵袭、 转移和血管生成的基因。ER - 和 ER + 细胞中 IL-8 表达的显著差异为进一步检验细胞抗 体芯片预测 ER 状态的能力带来了希望。如果这种 细胞抗体芯片技术也能够进行 ER 状态预测， 它会 比 cDNA 芯片技术更具优势， 因为只要取得患者的 血清甚至乳汁即可进行， 过程更简单快速。根据蛋 白质芯片所得的数据再采用传统的分子和细胞生物 学方法， 正如我们在这篇文章中所阐述的一样， 则可 以进行更深入和更具针对性的研究， 并在这个过程 中发现新的靶分子或新的机理。 参考文献 1Huang RP，Huang R，Fan Y，et al.Simultaneous detection of multiple cytokines from conditioned media and patient's sera by an antibody-based protein array system. Anal Biochem，2001， 294： 55- 62. 2Yoshimura T，Matsushima K，Tanaka S，et al. Purification of a human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor that has peptide sequence similarity to other host defense cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A， 1987， 84： 9233-9237. 3Walz A，Peveri P，Aschauer H，et al. Purification and amino acid sequencing of NAF，a novel neutrophil-activating factor produced by monocytes. Biochem Biophys Res Commun， 1987， 149： 755-761. 4Hack CE，Hart M，van Schijndel RJ，et al. Interleukin-8 in sepsis： relation to shock and inflammatory mediators. Infect Immun，1992， 60： 2835-2842. 5Li J，Kartha S，Iasvovskaia S，et al. Regulation of human airway epithelial cell IL-8 expression by MAP kinases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2002， 283： 690-699. 6Huang S，Mills L，Mian B，et al. Fully humanized neutralizing antibodies to interleukin-8（ABX-IL8）inhibit angiogenesis，tumor growth，and metastasis of human melanoma. Am J Pathol，2002， 161： 125-134. 7Olbina G，Cieslak D，Ruzdijic S，et al. 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Nature，2002， 415： 530-536. （收稿日期： 2004-11-01） （本文编辑： 韩静） 第八届全国显微外科学术会议暨国际显微外科研讨会征文通知 为促进我国的显微外科学术交流与发展， 展示近年来显微外科专业的新进展和新成果， 中华医学会显微外科分会拟定于 2006 年 9 月在山东青岛市召开第八届全国显微外科学术会议暨国际显微外科研讨会。会议期间将邀请国内外知名专家教授 做专题报告， 并进行中青年优秀论文评选。 1. 征文内容：（1） 显微外科基础研究；（2） 显微外科新理论、 新经验、 新方法、 新技术、 新应用；（3） 显微外科技术在临床各专 科的应用；（4） 显微外科监护和护理；（5） 显微外科领域的国内外进展；（6） 其他与显微外科有关的内容。 2. 征文要求：（1） 请寄未曾发表的论文全文 （4000 字以内） 及结构式摘要 （500 字以内） 各 1 份， 并附寄软盘或者发送电子 邮件；（2） 参加优秀中青年论文评选者， 第一作者年龄需在 45 岁以下 （附单位证明） ；（3） 在信封上注明 “显外会议” 字样；（4） 截稿日期： 2006 年 4 月 31 日。来稿请寄： 上海市凤阳路 415 号长征医院骨科资料室许丽英收， 邮政编码： 200003； 电话： 021- 63610109-73337； Email： shiminchang yahoo. com. cn。 ·4451·中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23