祛风止痉方对哮喘大鼠转录因子T-bet GATA-3及TNF-α的调节作用.pdf

2010 卑 第2 4 卷第3 期 实用中医内科杂志 J O U R N A LO FP R A C l l C A LT R A D m O N A LC H I N E S EI N T E R N A LM E D I C I N E 祛风止痉方对哮喘大鼠转录因子T b e tG A T A 一3 及T N F 一仅的调节作用 杨春华1 ，李风森2 ( 1 新疆医科大学研究生学院，新疆鸟鲁木齐8 3 0 0 5 4 ；2 新疆维吾尔自治区中医医院，新疆鸟鲁木齐8 3 0 0 0 0 ) 摘 要： 目的 证实祛风止痉方对哮喘大鼠治疗作用的部分机理是通过对转录因子T b e t 、G A T A 一3 及T N F c t 的调节起作用的。 方法 6 0 只大鼠随机分组为哮喘模型组、正常对鼹组及给药组( 高中低剂量) 建立大鼠哮喘模型，并 分别给药。用I 盯一P C R 检测T b e t 、G A T A 一3 表达水平，双抗体夹心E L I S A 法测定T N F a 浓度。 结果 模型组大鼠 外周血中转录因子C A T A 一3 高于正常对照组及给药组，比较有统计学意义( P 0 0 5 ) ；中低剂量组比较无统计学意义( P 0 0 5 ) ；中低两组高于正常组，比较有统计学意义( P 0 0 5 ) 。模型组 大鼠外周血中转录因子T b e t 的表达量低于正常对照组及给药组，其差异具有统计学意义( P 0 0 5 ) ；m i d d o s a g ec o m p a r e dw i t l Il o w d o s a g e ，t h e r ei sn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P 0 0 5 ) ；m i d d o s - a g ea n dl o w d o s a g eg r o u ph i g h e rt h a nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，i th a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P 0 0 5 ) T h eT b e t e x p r e s s e di nm o d e lg r o u ps i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn o r m a lc o n t r o lg r o u pa n dt r e a t m e n tg r o u p s ，i th a ss t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( 尸 O 0 5 ) ；l o w d o s a g eg r o u pl o w e rt h a nh y p s i d o s a g eg r o u p ，i th a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P O 0 5 ) ；m i d d o s a g ea n dh y p s i d o s a g eg r o u ph i g h e rt h a nm o d e lg r o u p ，i th a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P 0 0 5 ) T h eT N F a e x p r e s s e di nb l o o ds e n l n l ，m o d e lg r o u ph i g h e rt h a nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，i th a ss t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( P 0 0 5 ) ；h y p s i d o s a g eg r o u pl o w e rt h a nm o d e lg r o u p ，i th a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P 0 0 5 ) C o n c l u s i o n Q u f e n g Z h i j i n g F a n gc a nr e d u c eG A T A 一3a n dr a i s eT b e te x p r e s s e di np e r i p h e r a l b l o o d ，8 0t h a tt h eb a l a n c eT h l T h 2c a nr e v e r t ，m e a n w h i l e ，i tc a l ' lr e d u c eT N F o t e x p r e s s i o n S ot h a ti tc a na c h i e v et h ea i mo ft r e a ta 8 t h x x l ab yr e d u c et h eAHRi na s t h m a t i cr a t s K e yW o r d s ：q u f e n g z h i j i n g f a n g ；t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ；T b e t 、G A T A 一3 ；T N F 一( I t 哮喘的发病机制极为复杂，其中T h l T h 2 ( 辅助 性T 淋巴细胞) 亚群功能失衡是哮喘发病的重要机 制，T h l 、T h 2 是有共同的前体细胞T h 0 分化而来，而 辅助性T 淋巴细胞分化特异性转录因子T b e t 和 G A T A 一3 是特异性调控T h 0 分化、决定T h l T h 2 转 换的关键因子。有研究发现n 1 ，哮喘表现为转录因子 T b e t 和G A T A 一3 失衡表达，从而决定了T h l T h 2 平衡的稳定性。肿瘤坏死因子( T N F d ) 是一种前 万方数据 实用中医内科杂志 ·2 8 。 J O U R N A LO FP R A C T I C A LT R A D I T I O N A LC H I N E S EI N T E R N A LM E D I C I N E M 盯2O1O V 0 1 2 4N o 3 炎症细胞因子，是机体炎症及免疫反应与增加单核细 胞活化的重要调节因子，能促进哮喘发作并加重气道 炎症，在哮喘气道慢性炎症发生发展过程中起重要作 用。近年来，在临床中运用祛风止痉方治疗哮喘取得 了满意的疗效，并通过动物实验证实其疗效确切。本 实验拟通过哮喘模型研究祛风止痉方对转录因子 G A T A 一3 ，T b e t 及T N F 一0 【表达的影响，进一步探 讨其作用机理。 1材料与方法 1 1 材料6 0 只2 3 个月W i s t e r 大鼠( 新疆医 科大学实验动物中心提供) ，体重1 8 0 2 2 0 9 ，雌雄不 限，分笼饲养( 造模过程中死亡3 只) 。卵白蛋白 ( O V A ) 为美国S i g m a 公司产品；氢氧化铝购自上海金 山化工；淋巴细胞分离液为北京S o l a r b i o 公司生产； T r i z o l 为美国i n v i t r o g e n 公司产品；反转录试剂盒为美 国P r o m e g a 公司；P C R 试剂盒由北京博迈德生物生 产；引物为上海生工及北京博迈德产品；D N A 标记 ( M a r k e r ) 由博迈德公司提供；T N F 一位E L I S A 试剂盒： 武汉博士德生物工程有限公司。 1 2 药物组成与制奋组方主要为蝉蜕、僵蚕、防风 等。制备方法：按高中低剂量分为三组煎煮，方法相 同。先将方中中药饮片粉碎成较小饮片，加水浸泡 4 0 I I l i n ( 液面没过饮片l 2 c m 约3 0 0 m L ) ，然后头煎 4 0 r a i n ，滤出药液，二煎3 0 r a i n ，合并2 次滤液，浓缩至 所需毫升数，每日1 次。 1 3 模型的制备与处理大鼠采用随机盲法对照 原则分为正常对照组、哮喘模型组、治疗组( 分为高、 中、低药物剂量) ，模型组与治疗组每只大鼠均于实 验的第1 天、第8 天和第1 4 天共3 次在腹腔分2 点 注射含1 5 m gO V A 和1 0 m g m ( O H ) 3 的生理盐水1 m L ， 于致敏第1 5 天，每日以1 卵白蛋白生理盐水对动 物放人自制的密闭有机玻璃箱中进行超声雾化吸入， 诱发其哮喘发作连续激发3 天，每天3 0 r a i n ，正常对 照组予生理盐水代替抗原进行致敏和激发。三组均 从激发那天开始给药，每日2 次，疗程1 5 天。正常对 照组给予生理盐水2 m L 次，哮喘模型组给予生理盐 水2 m L 次，药物治疗高中低剂量组分别给予中药汤 剂2 m L 次( 各组中药浓度高剂量组为1 6 9 m L 。中剂 量组为0 5 9 m L ，低剂量组为0 2 m L ) 。 1 4 标本取材方法造模完成后，各组大鼠经3 戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，待大鼠进入麻醉状态后， 打开腹腔，充分暴露腹主动脉，采大鼠动脉血2 m L ， E D T A 抗凝处理；另取未抗凝处理鲜血2 m L 提取血清 一2 0 保存待用。 1 5 测定方法逆转录一聚合酶链反应( R T P C R ) 检测T b e t 、G A T A 一3 表达水平。采血后用淋 巴细胞分离液及1 6 4 0 液分离淋巴细胞，采用T r i z o l 等试剂提取淋巴细胞R N A ，再逆转录为互补脱氧核 糖核酸( c D N A ) ，以此为模板行P C R 扩增。目的基因 引物序列：T b e t ( P C R 产物为4 3 6 b p ) 上游引物：5 一从C C A C T A T C C T G T C T C C A C C 一3 ，下游弓I 物：5 一T G T C G C C A C T G G A A G G A T A G 一3 退火温度为 5 7 上海生工提供) 。G A T A 一3 ( P C R 产物为 4 1 1 b p ) 上游引物：5 一C A G T C C G C A T C T C T r C A C 一 3 ，下游引物5 一T A G T G C C C A G T A C C A T C T C 一3 ， 退火温度为5 2 0 C 。p a c t i n 上游引物：5 一T C C T - G T G G c A T c C A T G A A c T 一3 ，下游弓l 物：5 一 G A A G C A 唧C G G T G C A C G A T 一3 ，退火温度为 5 2 ( 北京博迈德生物) ，P C R 产物用2 琼脂糖凝胶 电泳，比较T b e t 、G A T A 一3 、与B a c t i n 的相对值并 进行半定量分析。采用双抗体夹心E L I S A 法测定 T N F a 浓度。 2数据分析与结果 各组数据均值以( 菇±3 ) 表示，用S P S S l 6 ，0 统计 软件进行分析，五组样本均数比较采用方差分析，若 方差齐两两比较用q 检验，方差不齐用秩和检验；以 P 0 0 5 有统计学意义。 电泳结果表明：T b e t 和G 舳t 一3 分别在 D N A m a r k e r 4 3 6 b p 及4 1lb p 处表达，在3 0 0 h p 处表达 为B a c t i n ( 如图l ，2 所示) 。半定量分析后各组间 比较结果见表1 。 图1 大鼠血中G A T A - 3 m R N A 表达 注：6 ：模型组7 ：对照组8 ：低剂量组9 ：中剂量组1 0 ：高 剂量组1 1 ：m a r k e rl 一5 为对应组的B e c t i n 图2 大鼠血中T b e t m R N A 表达 注：1 ：对照组2 ：高剂量组3 ：中剂量组4 ：低剂量组5 ：模 型组6 1 0 为对应组的B a c f i n1 1 ：m a r k e r 用E L I S A 测定血清T N F O t 表达，用酶标仪在 4 5 0 h m 测定O ，D 值，再用E L I S A 曲线修正软件计算 出各标本对应的浓度。各组间比较见表2 。 万方数据 20l0 年 第2 4 豢第3 期 实用中医内科杂志 J O U R N A LO FP R A C T I C A LT R A D m O R A LC H I N E S EI N T E R N A LM E D I C I N E 2 9 · 裹1各组大鼠肺组织中T I ) e t m R N A 和 G A T A 一3 mR N A 表达量比较( ；±s l 注：T Y 差齐性检验P = O 0 9 7 及P = 0 0 5 2 ，两组值方差齐，两两比 较用q 检验。与正常对照组比较P O 。0 5 有统计学意义：与哮喘 模型组比较P O 0 5 有统计学意义；o 与高剂量组比较P O 0 5 有统 计学意义；与中剂量组比较P ( O 0 5 有统计学意义。 表2 各组大鼠肺组织中I N F a 浓度比较( ；±j ) 注：由于标本存放不当，低剂量组丢失3 例。方差齐性检验：P = 0 0 0 5 ，方差不齐，采用K r a s k a l W a l l i s 秩和检验P = 0 0 2 4P 0 0 5 。 五组总体均数不全相等，两两比较用D u n n e t tC 检验。与正常对照 组比较P 0 0 5 有统计学意义；与哮喘模型组比较P 0 0 5 有统计 学意义。 3讨论 哮喘发作前常有鼻痒、眼痒、喷嚏、流涕和咳嗽等 先兆症状。发病迅速，时发时止，反复发作。发作时 痰鸣气喘，与风邪的特征极为相似，因此认为“风盛” 是哮喘病证的病理因素之一，气道挛急、肺管不利、痰 壅痰鸣是风邪侵袭机体后产生的病理结果】。内 经中有“风性善行而数变”“风为百病之长”之说，中 医所说的“风邪”，内涵包括一切吸入性致病因子( 如 花粉、屋尘、螨、烟尘及各种异味等) ，各种理化因素、 气候变化等等。总之，凡从呼吸道吸入的致病因子， 均属风邪致病的范畴p 】。因此提出祛风止痉法是治 疗哮喘的有效方法之一，并根据此治疗大法组方，主 要药物为蝉蜕、僵蚕、防风等。现代药理研究表明：蝉 蜕、僵蚕等均有抗过敏解痉作用一有提高细胞免疫功 能、减轻机体对过敏因素的应激反应，拮抗组胺，抗过 敏性炎症，可使肺之小气道由痉挛变为舒张，使气道 通顺等作用”J 。笔者于前期动物实验中证实该方可 减低I L 一4 及I L 一2 的表达从而有效治疗哮喘【6 J 。 转录因子T b e t 和G A T A 一3 特异性调控T H O 细胞相应的分化为T H l 和T H 2 ，并具有交互抑制作 用H 1 。T h l 细胞释放的I F N 一1 ，m 一2 等对T h 2 的功 能具有拮抗作用而减低哮喘的发作；T h 2 淋巴细胞分 泌几一4 ，I L 1 3 等细胞因子，促进B 细胞合成过敏 原特异性I g E ，介导哮喘发生及增加气道高反应，是 气道炎症反应的重要效应细胞。S z a b o 等¨1 发现了 T h l 特异性转录因子T b e t 能控制T h l 细胞特征性 细胞因子I F N 一y 的表达，能抑制T h 2 细胞特征性细 胞因子I L 一4 的产生，并可将已经完全极化的T h 2 细 胞逆转为n l 细胞，能够阻断或抑制T h 2 细胞分化信 号，从而减低哮喘的发生。G A T A 一3 调节着T h 2 细 胞因子的表达【9 】，同时抑制n l 的细胞的分化。N a k a m u r a 等¨则研究证实：哮喘气道G A T A 一3m R N A 的表达明显增加，G A T A 一3m R N A 的细胞数与气道 管径降低及气道高反应性明显相关。T N F d 是由 单核巨噬细胞产生的具有广泛生物活性的多肽调节 因子，与机体炎症有着极为密切的关系¨1 1 。它通过 增加细胞间黏附分子表达、诱导血小板活化因子及 I L 一1 、5 、8 的释放，刺激白三烯和嗜酸性粒细胞阳离 子蛋白等过敏毒素的合成，导致哮喘时气道高反应性 的发生【l “。有研究表明：哮喘病情越严重，持续时间 越i f = ，其血清T N F q 浓度越高，反之病情越轻H 引。 通过本实验研究发现，祛风止痉方可增加转录因 子T b e t 的表达，减低转录因子G A T A 一3 及T N F a 的表达，因此可证实祛风止痉方是通过增加转录因 子T b e t 的表达，减低转录因子G A T A 一3 的表达来 恢复，1 1 l l ，n 1 2 平衡，从而达到治疗哮喘的目的。同 时对祛风止痉方在哮喘大鼠体内发挥治疗作用的最 佳药物剂量进行了探索，高剂量组较中低剂量组可明 显增加转录因子T b e t 的表达，减低转录因子G A T A 一3 的表达及，I N F d 的浓度，从而发现高剂量组疗 效最佳。当然，其最佳剂量与安全性之间的关系尚需 进一步探索。 参考文献 1 刘春涛，王刚，罗凤鸣，等支气管哮喘患者1 1 1 0 细胞过度分化与 转录因子T b e t 和G A T A - 3 的调控作用 J 】中华结核和呼吸杂 志，2 0 0 4 ，2 7 ( 6 ) ：3 9 8 4 0 2 C 2 樊长征，焉石，李友林，等祛风解痉法治疗哮喘病证源流考 J 】 时珍国医国药。2 0 0 7 ，1 8 ( 1 2 ) ：2 8 7 7 E 33 王德钧，谈欧韩树人主任医师祛风法治疗哮喘经验 J 中国临 床医生杂志，2 0 0 7 ，3 5 ( 9 ) ：6 3 4 朱良春虫类药的应用 M 大同：山西科学出版社，1 9 9 4 5 王强，孙增涛祛风止痉法治疗咳嗽变异性哮喘 J 3 吉林中医药， 2 0 0 7 ，2 7 ( 1 0 ) 6 3 姚梓平李风森，杨剑。祛风止痉”方对支气管哮喘大鼠模型儿一 2 、I I J 一4 的影响 J 新疆中医药，2 0 0 9 ，( 2 ) ：2 5 7 C h a k i r H ，w 叫g H ，L d e b v r eD E e ra l ·T b e t a G A T A 一3I v t i o 柚 矗n ×埔s u l eo ft h e T h l T h 2c y t o k l n ep r o m ei n m i x e dc e U p o p u l a f i o n B ：p m d o n l i n a n tr o l e o f G A T A - 3 ·J l n n n u n o l M e t h o d s ，2 0 0 3 ，2 7 8 ( 1 - 2 ) ： 1 5 7 8 S u d ' oS J ，I G mS T ，C o s t aC L ，e ta 1 An o v e lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，T b e t a ，d i r e c t sT h ll i n e a g ec o m m i t m e n tC e l ，2 0 0 0 。1 0 0 ( 6 ) ：6 5 5 9 3s z a b oS J ，K i mS T ，C o s t aC L ，e ta 1 An o v e lt r a n s c r i p t i f a c t o r ，T b e t ，d i r e c t sT h ll i n e a g ec o m m i t m e n t J c e l 。2 0 0 0 ，1 0 0 ( 6 ) ；6 5 5 6 6 9 1 0 N a k a m u r a Y ，G h a f f a r O ，O l i v e n s t e l n R ，e ta 1 C , e n e “一p l 慧B 醯o no f & G A T A 一3U m m - d p t i o nf a c t o ri si n c r e a s e d i na m p i ca s t h m a J J A i l e r - 口C l i n m m u r l o ，1 9 9 9 ，1 0 3 ( 2 ) ：2 1 5 - 2 2 2 1 1 S a b a f i n iF ，S f l v e s t r iM ，S a l eR 。e la 1 F i b r o b l a s t 一i n o p h i li n t e r a c - t i m ：m o d u l a t i o no fa d h e s i o nm o l e c u l e se x p r e s s i o ne n dc h e m o k i n er e - l e a s eb y h u m a nf e t a ll u n gf i b r o b l a s t si nr e s p o n s et ol L 一4t m d T N F a l p h a J I m m u n o lL e t t ，2 0 0 2 ，8 4 ( 3 ) ：1 7 3 1 7 8 1 2 G n e l e w B k a I L 目y m o w s k al 。P i e t l - z k o w i e zM R o l e0 ft u m o rn e c r o s i s f a c t o r a l p h a i na l l e r g i ci I I f I a m I l l a t i a n da i r w a yh y p e r r e s p o n s i v e n e e e J P o lM e r k u rL e k a r s k i ，2 0 0 4 。1 6 ( 9 2 ) ：1 7 3 1 7 8 1 3 曾翠，张映松老年哮喘患者血清I L 1 3 、田吓一a 与l g E 水平的 探讨 J 国际医药卫生导报，2 0 0 7 ，1 3 ( 2 0 ) ：1 6 ( 收稿日期：2 0 0 9 一l l 一0 6 ) 万方数据