结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞转分化的调节机制.pdf

基金项目： 湖北省科技攻关计划资助项目 （2003AA301C14） 作者单位： 430022 武汉， 华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科 ·论著· 结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞 转分化的调节机制 张春 朱忠华 刘建社 杨晓 邓安国 【摘要】 目的 观察结缔组织生长因子 （CTGF） 对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化的直接 影响， 并探讨阻断内源性 CTGF 表达对转化生长因子-1 （TGF-1） 诱导人肾小管上皮细胞转分化的 干预效果， 以阐明 CTGF 在肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法 体外培养人近曲小管上皮细胞 （HKC） 。在观察 CTGF 对 HKC 的直接作用时， 将 HKC 细胞分为三组：（1） 对照组；（2） 小剂量 CTGF 组： 培养液中加入重组人 CTGF （rhCTGF） ， 终浓度为 2. 5 µg/ L；（3） 大剂量 CTGF 组：rhCTGF 终浓度 为 5. 0 µg/ L。在探讨 CTGF 在 TGF-1 诱导 HKC 转分化中的作用时， 将细胞分为 4 组：（1） 正常对照 组；（2） TGF-1 刺激组 （培养液加入重组人 TGF-1 蛋白， 浓度为 10. 0 µg/ L） ；（3） TGF-1 + CTGF 正 义寡核苷酸 （ODN） 组 （先以 CTGF 正义 ODN 转染 HKC， 再加 TGF-1 刺激） ；（4） TGF-1 + CTGF 反义 ODN 组 （先以 CTGF 反义 ODN 转染 HKC， 再加 TGF-1 刺激） 。用逆转录-聚合酶链反应 （RT-PCR） 方 法测定 HKC -平滑肌肌动蛋白 （-SMA） 和型胶原 （col ）mRNA 水平的变化； 间接免疫荧光方法 检测 HKC 胞浆内 -SMA 的表达； 流式细胞仪检测 -SMA 阳性细胞百分率；ELISA 方法测定培养液 上清中 col 的浓度。结果 不同浓度 rhCTGF 作用于 HKC 24 h 后， -SMA mRNA 水平显著升高 （P 0. 01） ， 而 col mRNA 表达水平明显下降 （均 P 0. 01） ； 刺激48 h 后， 胞浆 -SMA 表达明显增强， 流式细胞仪测得三组细胞 -SMA 阳性百分率依次为： 2. 4%、 38. 9%、 65. 5%（P 0. 01） ； ELISA 结果 表明， rhCTGF 抑制了 col 的分泌 （P 0. 01） 。TGF-1 可诱导 HKC 高表达 CTGF 和 -SMA。转染后 6 h， CTGF 反义 ODN 可显著抑制 HKC 表达 CTGF 和 -SMA mRNA （P 0. 01） 。转染后48 h， CTGF 反 义 ODN 可明显抑制胞内 -SMA 蛋白合成。结论 CTGF 在体外能刺激肾小管上皮细胞向肌成纤维 细胞 （MyoF） 转分化， 而 CTGF 反义 ODN 的导入可有效抑制 TGF-1 诱导的转分化过程。因此，CTGF 可能是调节肾小管上皮细胞转分化的重要因子。 【关键词】 生长物质； 肾小管； 上皮细胞； 肌动蛋白类； 胶原 Role of connective tissue growth factor in human renal tubular epithelial cell transdifferentiation in vitro ZHANG Chun，ZHU Zhong-hua，LIU Jian-she，YANG Xiao，DENG An-guo.Department of Nephrology，Union Hospital ，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430022，China 【Abstract】 Objective To observe the effect of connective tissue growth factor（CTGF）on the transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells and to explore the influence of CTGF antisense oligodeoxynucleotide（ ASODN）transfection on the transdifferentiation process induced by transforming growth factor-1（TGF-1） . Methods Human renal tubular epithelial cells of the strain HKC were cultured and divided into 3 groups： （1）negative control group， （2）low dose CTGF group，treated with recombinant human CTGF（rhCTGF）with the terminal concentration of 2. 5 µg/ L，and（3）high dose CTGF group，treated with rhCTGF with the terminal concentration of 5. 0 µg/ L） .To evaluate the contribution of CTGF to the transdifferentiation induced by TGF-1，Another HKC cells were divided into 4 groups： （1）untreated control group（Group C） ， （2）Group T，stimulated by TGF-1（10. 0 µg/ L） ， （3） Group S，stimulated by sense ODN transfection + TGF-1（10. 0 µg/ L） ，and（4）Group A，stimulated by antisense ODN transfection + TGF-1（10. 0 µg/ L） . RT-PCR was used to detect the mRNA expression of -smooth muscle actin（-SMA）and collagen type （col ）mRNA. Indirect immunofluorescence assay and flow cytometry were used to assess the level of intracellular -SMA protein.ELISA was used to determine the concentration of col in the media. Results The normal HKC cells were round and the ·0292·中华医学杂志 2005 年 11 月 2 日第 85 卷第 41 期 Natl Med J China，November 2， 2005， Vol 85，No. 41 HKC cells stimulated with rhCTGF became elongated. Upon the stimulation of different concentrations of rhCTGF，the expression of -SMA mRNA increased markedly （both P 0. 01） ， while the mRNA expression of collagen type gene was down-regulated significantly（both P 0. 01） . The percentage of -SMA positive cells was significantly higher in the stimulated groups than that in negative control with significant difference among any 2 groups（38. 9%，65. 5% vs. 2. 4% respectively，all P 0. 01） . Under this condition，collagen type secreted into the culture medium was lowered markedly upon the induction of CTGF（P 0. 01） . RT-PCR analysis showed that the CTGF gene expression was upregulated by TGF-1 stimulation and peaked in 3 hours，and the -SMA expression was upregulated by TGF-1 stimulation， however，peaked in 6 hours. The CTGF mRNA expression of the HKC cells transfected with CTGF ASODN that was stimulated by TGF-1 10 µg/ L was significantly suppressed（P 0. 01）and the -SMA mRNA expression induced by TGF-1 10 µg/ L was significantly inhibited by CTGF ASODN transfection（P 0. 01） . Indirect immunofluorescence assay showed that normal HKC cells did not express -SMA， 48 hours after stimulation of TGF-1 10 µg/ L the HKC cells showed expression of -SMA in the cytoplasm，and the intracytoplasmic -SMA expression was significantly down0regulated by the transfection of CTGF ASODN （P 0. 01） . Conclusion CTGF can promote the transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells towards myofibroblast（MyoF）in vitro，and CTGF blockade results in a dramatic inhibition of TGF- induced transdifferentiation of renal tubular cells. So CTGF may be a crucial factor in promoting tubular- epithelial myofibroblast transdifferentiation. 【Key words】 Growth substances； Kidney tubules； Epithelial cells； Actins； Collagen 细胞因子在肾小管上皮细胞-肾间质肌成纤维 细 胞（ myofibroblast， MyoF ）转 分 化（ tubular epithelial-mesenchymal transdifferentiation，TEMT） ， 乃至肾小管间质纤维化的发生中起着重要的始动作 用。大量证据表明， 转化生长因子- （transforming growth factor-，TGF-） 是肾小管间质纤维化进程 中最主要的生长因子之一 1， 包括对 TEMT 的诱导。 结缔组织生长因子 （connective tissue growth factor， CTGF） 是一种新发现的生长因子， 近来研究发现， 在 多种肾小球和肾间质性疾病状态下， CTGF 表达上 调并与肾小管间质纤维化程度相关 2。尽管有学 者推测 CTGF 可能是 TGF-1 促纤维化作用的重要 下游介质， 但 CTGF 对 TEMT 的直接影响， 及其在 TGF-1 诱导 TEMT 中所起的作用仍未明确。本研 究拟通过观察 CTGF 对体外培养的人近曲小管上皮 细胞 （HKC） 表型的影响， 以及阻断内源性 CTGF 产 生对 TGF-1 诱导的 TEMT 过程的干预效果， 初步 探讨 CTGF 在 TEMT 过程中的作用。 材料与方法 一、 材料 人肾小管上皮细胞 HKC 株 （南京军区南京总 医院肾内科刘志红院士惠赠） ， RPMI 1640 培养基和 胎牛血清 （FCS） （美国 Invitrogen 公司） ， 重组人 CTGF 蛋白 （rhCTGF）（美国 FibroGen 公司） ， 重组人 TGF-1 蛋白 （rhTGF-1）（美国 R&D System 公司） 。 小鼠抗人 -平滑肌肌动蛋白 （-SMA）（美国 Sigma 公司） ， FITC-羊抗小鼠抗体 （北京中山生物技术有 限公司） ， 型胶原 （col ） 酶联免疫吸附反应 （ELISA） 试剂盒 （深圳晶美生物工程公司） 。Trizol Reagent（美国 Invitrogen 公司） ，cDNA 第一链合成 试剂盒、 Taq 酶和 dNTP（立陶宛 MBI 公司） ，DNA maker（DL2000， 大连宝生物公司） ， 聚合酶链反应 引物 （上海生工生物工程技术服务有限公司） ， 引物 序列和扩增片段长度见表 1。 二、 方法 1. 细胞培养及分组： HKC 用含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养液传代培养， 培养条件为 37， 5% CO2。为观察 CTGF 对肾小管上皮细胞转分化的影 响， 将 HKC 分为 3 组：（1） 对照组： 加入含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养液；（2） 小剂量 CTGF 组： 在培养 液中加入 rhCTGF（终浓度为 2. 5 µg/ L） ；（3） 大剂 量 CTGF 组： 在培养液中加入 rhCTGF （终浓度为5. 0 µg/ L） 。每组设 3 个复孔 （瓶） ， 作用不同时间后收 集细胞和培养液用于各项检测。为探讨 TGF-1 对 HKC 表达 CTGF 和 -SMA mRNA 的影响， 在去血清 静止的 HKC 培养液中加入 TGF-1， 终浓度为 10. 0 µg/ L。分别刺激 0、 3、 6、 12、 24 h 后， 收集细胞用于 RT-PCR 检测 （每个时间点 3 瓶细胞） 。为研究 CTGF 反义寡核苷酸 （oligodeoxynucleotide，ODN） 对 TGF-1 刺激 HKC 表达 -SMA 的影响， 以 CTGF 反 义 ODN 转染 HKC 后， 加入 10. 0 µg/ L TGF-1。每 组设 3 个复孔 （瓶） ， 作用 6 或 48 h 后分别收集细胞 用于 RT-PCR 和间接免疫荧光检测。 2. 细胞转染： 全程硫代磷酸化修饰的 CTGF ODN 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成， 序列如下： 反义 ODN： 5'TACTGGCGGCGGTCAT 3'； 正义 ODN： 5'ATGACCGCCGCCAGTA 3'。用脂质体 ·1292·中华医学杂志 2005 年 11 月 2 日第 85 卷第 41 期 Natl Med J China，November 2， 2005， Vol 85，No. 41 Lipofectamine（美国 Invitrogen 公司） 将 CTGF 反义 ODN 转染 HKC， 转染后加入 TGF-1 （10. 0 µg/ L） 分 别作用 6 或 48 h 后， 收集细胞及培养液用于以下各 项检测。按同样方法进行正义 ODN 的转染。 3. HKC 形态学观察： 加入各组试剂后， 每6 h 在 相差显微镜下观察一次细胞形态， 48 h 后相差显微 镜下摄像。 4. RT-PCR 计算各指标相对表达量： 按照 Trizol 说明书在培养瓶中提取总 RNA， 经紫外分光光度计 鉴定， 各组 260 nm/280 nm 吸光度比值为 1. 8 2. 0， 表明所提取的 RNA 纯度高。根据260 nm 吸光 度值计算 RNA 浓度。取总 RNA 2 µg 作逆转录， 步 骤参照试剂盒说明。取 1 µl 逆转录产物为模板， - SMA、 col 、 CTGF 和 -肌动蛋白同等条件扩增。 反应参数如下： 预变性 94 5 min， 变性 94 45 s， 退火 55 45 s， 延伸 72 60 s， 32 个循环 （-肌动 蛋白仅27 个循环） ， 最后72 继续延伸10 min。取 PCR 产物 5 µl 在 1. 5% 琼脂糖凝胶上电泳， 观察结 果并照相， 用计算机图像处理系统处理， 以密度代表 表达量， 计算出 CTGF、 -SMA、 col 的相对表达量 （即目的基因条带吸光度/ -肌动蛋白基因条带吸 光度） 。至少重复 3 次独立的 RT-PCR 全过程。 5. 间接免疫荧光： 加入各组试剂 48 h 后， 取出 培养板中的预置玻片， PBS 洗涤 3 min × 3 次； 投入 乙醇-丙酮固定细胞15 min； 0. 5% Triton X-100 浸泡 细胞 10 min； PBS 洗涤 3 min × 3 次； 滴加正常兔血 清封闭， 37 温箱放置 45 min； 加入稀释的抗 - SMA （1 : 50） 抗体， 4 过夜； 次日晨， PBS 洗涤 3 min ×3 次； 加入 FITC-羊抗小鼠抗体， 37温箱放置 45 min， 缓冲甘油封片， 荧光显微镜下观察， 进行图 像分析并照相。 6. 流式细胞仪技术测定 -SMA （ + ） 细胞百分 数 ： 各组 HKC 加入有关试剂后48 h， 以0. 25%胰蛋 白酶消化细胞后收集细胞悬液， 以 1% 甲醛-甲醇固 定， Triton-X-100 和枸橼酸钠打孔后加入抗 -SMA 抗体， PBS 漂洗后加 FITC-羊抗鼠抗体。将上述细胞 悬浮于 PBS 中避光保存， 以流式细胞仪测定 -SMA （ + ） 细胞百分数。 7. ELISA 方法测定 col 的浓度： 各组 HKC 加 入 rhCTGF 刺激 48 h 后， 取上清按 col -ELISA 检 测试剂盒说明书测定其中 col 的浓度。 8. 统计学处理： 数据以 -x ± s 表示， 计量数据的 比较采用单因素方差分析和 q 检验； -SMA （ + ） 细 胞率的比较采用 x2检验， P 0. 05 为差异有统计学 意义。所有数据计算均由 SPSS 11. 0 统计分析软件 完成。 表 1 PCR 引物序列 引物名称引物序列 （5'3'）产物长度 （bp） -SMAP1： GCTCACGGAGGCACCCCTGAA 589 P2： CTGATAGGACATT GTTAGCAT col P1： CGGGGTTACAAGGTGTCATTGG332 P2： GCCAAGTATCTCACCTGG CTGFP1： AACTATGATTAGAGCCAACTGCCTG477 P2： TCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC -肌动蛋白 P1： CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG208 P2： GGAGCAATGATCTTGATCTTC 结果 1. rhCTGF 对 HKC 细胞形态的影响： 在相差显 微镜下， 正常 HKC 细胞呈圆形或类圆形， 在培养瓶 中单层贴壁生长。以2. 5 µg/ L rhCTGF 作用于 HKC 48 h 后， 培养的 HKC 形态发生改变， 表现为细胞变 长， 胞间连接变松散； 以 5. 0 µg/ L CTGF 刺激细胞 后， HKC 细胞形态变化更加显著： 开始表现为细胞 肥大， 然后细胞逐渐拉长为长梭形， 同时细胞贴壁生 长的方式也发生了一定改变 （图 1） 。 图1 CTGF 对 HKC 形态的影响 1A：正常 HKC 细胞形态， 1B： 2. 5 µg/ L rhCTGF 作用 48 h， 1C： 5. 0 µg/ L rhCTGF 作用 48 h 相 差显微镜 ×200 2. rhCTGF 对 HKC -SMA 和 col mRNA 水平 的影响： RT-PCR 结果显示， 正常 HKC 几乎无 - SMA mRNA 表达， 有少量 col 表达。加入 rhCTGF （2. 5 µg/ L） 24 h 后， HKC -SMA mRNA 水平明显高 于对照组 （P 0. 01） ； 而 col mRNA 表达水平则 明显 下 降（ P 0. 01 ） 。 在 大 剂 量 CTGF 组 （5. 0 µg/ L） 这种变化更加显著 （P 0. 01， 图 2） 。 3. rhCTGF 对 HKC 胞内 -SMA 表达的影响： 在 荧光显微镜下， 正常 HKC 无 -SMA 表达， 培养液加 入 rhCTGF （2. 5 µg/ L） 48 h 后， 胞浆内 -SMA 表达 呈阳性， 大剂量 CTGF 组细胞胞浆内 -SMA 阳性表 达更加明显 （图 3） 。 4. rhCTGF 对 HKC -SMA （ + ） 细胞百分率的影 ·2292·中华医学杂志 2005 年 11 月 2 日第 85 卷第 41 期 Natl Med J China，November 2， 2005， Vol 85，No. 41 响： 流式细胞仪检测结果显示， 对照组 HKC -SMA （ + ） 细胞百分率为 2. 4%， 培养液加入 rhCTGF （2. 5 µg/ L） 48 h 后， -SMA （ + ） 细胞百分率为 38. 9%， 大剂量 CTGF 组 （5. 0 µg/ L） HKC -SMA （ + ） 细胞 百分率为 65. 5%， 三组间两两比较差异均有统计学 意义 （P 0. 01） 。 M：标准参照物， 1： 对照组， 2：2. 5 µg/ L rhCTGF 作 用 2 4 h ， 3 ： 5 . 0 µg / L rhCTGF 作用 24 h 图 2 CTGF 刺激后， HKC 表达 -SMA 和 col mRNA 的变化 （RT-PCR） 图 3 CTGF 刺激后， HKC 胞内 -SMA 蛋白表达的变化 3A：对 照组， 3B： 2.5 µg/ L rhCTGF 作用48 h ， 3C： 5.0 µg/ L rhCTGF 作用 48 h 间接免疫荧光 ×400 5. rhCTGF 对 HKC 分泌 col 的影响： 用 ELISA 方法测定上清中 col 的浓度， 发现2. 5 µg/ L CTGF 刺激 HKC 48 h 后， col 浓度较对照组明显降低 （P 0. 01） ； 5. 0 µg/ L CTGF 作用 48 h 后， col 浓 度降低更加显著 （P 0. 01） 。 6. TGF-1 诱 导 HKC 表 达 CTGF 和 -SMA mRNA 的时相效应： 在无血清静止的 HKC 中， 给予 10. 0 µg/ L TGF-1 分别刺激0、 3、 6、 12、 24 h， 以 RT- PCR 方法检测。结果发现， TGF-1 刺激 HKC 后， CTGF mRNA 水平很快上升， 与未处理组相比， 3 h 就迅速达到高峰 （P 0. 01） ， 此后峰度稍下降， 但仍 明显高于未处理组。-SMA mRNA 表达的峰值较 CTGF 延迟， 在刺激后 3 h 开始升高， 6 h 左右达到高 峰， 并在 12 24 h 持续保持高水平 （P 0. 01）（图 4， 5） 。 7. CTGF 反义 ODN 转染对 HKC CTGF 和 - SMA mRNA 水平的影响： 以 CTGF 反义 ODN 转染 HKC 后再加入 10. 0 µg/ L TGF-1 刺激 6 h， 用 RT-PCR方法检测 CTGF 和 -SMA 的基因表达。结 果发现， TGF-1 诱导的 CTGF mRNA 表达被显著抑 制 （P 0. 01） ， 表明转染成功。同时， CTGF 反义 ODN 有效抑制了 10. 0 µg/ L TGF-1 诱导的 - SMAmRNA 表 达， 而 CTGF 正 义 ODN 对 -SMA mRNA 的表达基本无影响 （P 0. 01）（图 6， 7） 。 M. 标准参照物 图 4 TGF-1 （10 µg/ L） 诱导 HKC 表达 CTGF 和 -SMA PCR 产物电泳结果 *与 0 h 比较 P 0. 01 图 5 TGF-1 诱导 HKC 表达 CTGF 和 -SMA mRNA 相对含量 ·3292·中华医学杂志 2005 年 11 月 2 日第 85 卷第 41 期 Natl Med J China，November 2， 2005， Vol 85，No. 41 8. CTGF 反义 ODN 转染对 HKC 胞浆 -SMA 表 达的影响： 免疫荧光检测结果显示， 正常 HKC 无 - SMA 表达， 10. 0 µg/ L TGF-1 作用于 HKC 48 h 后， 胞浆内 -SMA 表达明显增强， CTGF 反义 ODN 的导 入显著抑制了 -SMA 的表达 （P 0. 01）（图 8） 。 M. 标准参照物， 1：未处理组， 2：10. 0 µg/ L TGF-1 刺激6 h ， 3： CTGF 正义 ODN 转染 HKC 后再以 TGF-1 刺激6 h ， 4： CTGF 反义 ODN 转 染后再以 TGF-1 刺激 6 h 图 6 CTGF 反义 ODN 转染对 HKC CTGF 和 - SMA mRNA 表达 PCR 产物电泳结果 1：未处理组， 2：10. 0 µg/ L TGF-1 刺激 6 h ， 3：CTGF 正义 ODN 转染 HKC 后再以 TGF-1 刺激 6 h， 4：CTGF 反义 ODN 转染后再以 TGF- 1刺激6h； 与1组比较*P 0. 01， 与2组比 较#P 0. 01 图 7 CTGF 反义 ODN 转染对 HKC CTGF 和 - SMA mRNA 表达的影响 讨论 尽管肾小管上皮细胞本身亦可合成一些细胞外 图 8 CTGF 反义 ODN 转染对 HKC 胞内 -SMA 蛋白表达的影 响 8A：未处理组， 8B：10. 0 µg/ L TGF-1 刺激 48 h， 8C：CTGF 反义 ODN 转染后再以 10. 0 µg/ L TGF-1 刺激 48 h 间接免疫 荧光 ×400 基质 （extracellular matrix，ECM） 成分， 但一般认为， MyoF 才是肾间质纤维化时 ECM 的主要来源 3。 MyoF 表达特征性的 -SMA， 其数量与肾脏疾病的 进展密切相关 4。新近的研究资料显示， 由肾小管 上皮细胞转分化而来的 MyoF 约占肾间质 MyoF 总 数目的 1/3 5， 6， 因此， 阐明肾小管上皮细胞-MyoF 转分化 （TEMT） 的机理及调控机制， 对于深入了解 肾间质纤维化的发生机理及探讨相应的防治策略无 疑具有重要理论价值和实际意义。 上皮细胞-间充质转化 （EMT） 是指上皮细胞转 化为间充质细胞， 通常发生于胚胎发育和肿瘤形成 过程中 7。近几年的研究显示， 肾脏纤维化过程中 亦可发生 EMT。在某些病理因素的作用下， 肾小管 上皮细胞可获得某些间充质细胞表型， 如表达 - SMA 等而转化为 MyoF 4， 8， 并产生大量 ECM9， 10。 正常情况下， 肾小管上皮细胞表达角蛋白而不 表达 -SMA。本研究发现， 对照组 HKC 几乎无 - SMA mRNA 表达， 在 rhCTGF 作用下， HKC 表达高水 平的 -SMA mRNA， 提示 CTGF 可能刺激 HKC 胞内 -SMA 的转录。另外， 间接免疫荧光和流式细胞仪 的结果显示， HKC 在受 rhCTGF 刺激后 48 h， 胞浆高 度表达 -SMA， 这表明 HKC 在 CTGF 的作用下可能 由上皮细胞表型转变为 MyoF 表型 （即 TEMT） ， 而不 同剂量 CTGF 对 HKC -SMA 表达量的影响可能反 映了 CTGF 促进 HKC 转分化的作用是剂量依赖性 的， 这和 TGF-1 对肾小管上皮细胞的作用类似 4。 既往研究发现， 体外培养的肾小管上皮细胞在 EMT 过程中还可获得一种迁移性的表现型， 而基底 膜构成成分的变化如 col 的下调等， 是 TEMT 的 重要条件 11。本文发现， CTGF 能显著下调 col 的基因表达和蛋白分泌， 这可能是由于该剂量范围 CTGF 的刺激下， 基底膜型胶原的合成和分泌处于 受抑制状态。但是以往的研究曾证明， CTGF 可促 ·4292·中华医学杂志 2005 年 11 月 2 日第 85 卷第 41 期 Natl Med J China，November 2， 2005， Vol 85，No. 41 进体外培养的肾小管上皮细胞和成纤维细胞合成 ECM （如纤维粘连蛋白等） 12， 13， 因此本研究中 col 蛋白水平的下降是 CTGF 促进肾小管上皮细胞转 分化的作用机制之一， 抑或是由于转分化本身所导 致的基膜型胶原 （如 col 等） 分泌减少而间质型胶 原 （col 、 col 等） 分泌增加的结果尚有待于进一 步研究证实。但若以体外结果推论体内的 TEMT 过 程， 则 HKC col 水平的下降可能导致基底膜构成 成分变化， 完整性受损， 从而使细胞易于从基底膜脱 落。 最近的研究显示， 在多种细胞类型中， TGF- 促 进 ECM 生成的作用由 CTGF 所介导， 阻断 CTGF 的 表达能显著抑制 ECM 合成 12， 14。那么， TGF-1 诱 导的 TEMT 过程是否也由 CTGF 介导？为此， 我们 观察了 CTGF 在 TGF-1 诱导的 TEMT 中的作用。 RT-PCR 结果显示， 在 TGF-1 诱导下， HKC 胞内 CTGF 基因的转录水平迅速上升， 而 -SMA 基因的 上调迟于 CTGF 基因， 两者在表达时间上的先后差 异表明 TGF-1 可能先诱导 HKC 产生 CTGF， 而后 者促进 -SMA 表达。为了进一步验证以上假设， 本 研究采用了反义基因技术。RT-PCR 和免疫荧光结 果显示， CTGF 反义 ODN 的导入有效抑制了 TGF-1 诱导的 -SMA 基因和蛋白表达， 这表明 CTGF 可能 是 TGF-1 促 TEMT 作用的重要下游介质。 总之， 本研究表明， 单一 CTGF 刺激即可诱导正 常肾小管上皮细胞转分化为 MyoF， 而且 CTGF 还可 能是 TGF- 促进 TEMT 的重要下游介质。与本文 的结论相符合的是， Frazier 等 15在 5/6 肾切除大鼠 模型中发现， CTGF、 PDGF 和 TGF- 的表达与肾间 质 MyoF 分布区域基本一致。因此， CTGF 在肾间质 纤维化时的 TEMT 过程中可能起了重要的调控作 用， 干预 CTGF 的表达有望成为防治早期肾小管间 质纤维化的新靶向。 参考文献 1Border WA，Noble NA. 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