4762.赤芍中芍药苷的提取工艺研究 论文正文.doc

职业技术学院毕业论文（设计）毕 业 论 文（设计）题 目赤芍中芍药苷的提取工艺研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年5月3 0日3摘要本论文研究了赤芍中的芍药苷的提取与精制工艺，通过考察芍药苷的纯度和回收率，对提取和精制芍药苷的工艺进行了优化。结果表明采用70%乙醇回流提取3次，再依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂萃取，用硅胶柱层析进行纯化，纯化操作条件为氯仿-甲醇8:1、床层高度与直径比为18.5、负载量为20.7mg/g硅胶。使用该工艺可从赤芍中得到纯度大于97.0%的芍药苷产品，总回收率超过87.0%。关键词：赤芍；芍药苷；正丁醇；HPLC 目 录引言. 11材料与方法.11.1实验材料.11.2实验试剂.11.3实验仪器.21.4试验方法.21.4.1分析方法.21.4.1.1 TCL分析方法.21.4.1.2 HPLC定量 .21.4.2提取工艺流程. .31.4.3提取和纯化方法.32结果分析.42.1回流提取过程中的芍药苷提取情况.42.2萃取过程中的芍药苷提取情况.52.3纯化过程中的芍药苷情况.52.3.1 DA-201大孔吸附树脂的纯化情况.52.3.2 D-101大孔吸附树脂的纯化情况. . .52.3.3 硅胶的纯化情况 . . . . . . .63结论. . . .74展望.7参考文献.87职业技术学院毕业论文（设计）引言芍药苷为赤芍的主要药效成分，具有镇静、镇痛、解痉、解毒、抗炎、抗过敏、血管扩张等药理活性，并有活血、化瘀、补阴等功效1,2。芍药苷为白色粉末，mp.172ºC，分子式C23H28O11，是一种蒎烷单萜苷3，在碱性溶液中不稳定，产生一定量的苯甲酸，放置后部分变成红棕色树脂物质，遇硫酸显紫褐色，紫外灯(254nm)下显暗斑。国内外对赤芍的化学成分和药材的溶剂提取进行了较多的研究4。从赤芍中提取芍药苷工艺过程的研究都是以提取少量样品用于鉴定、分析、药理研究为目的，因此过程较繁杂，且未对制备过程中芍药苷的回收率进行考察5。为了更好地利用赤芍资源，本论文通过考察芍药苷的纯度和回收率，对提取和精制芍药苷的工艺进行了优化。本论文的研究结果对芍药苷的大规模制备有一定的指导意义。1 材料与方法1.1实验材料 赤芍药材，产于购自河北安国药材市场，经浙江中医药大学陈孔荣教授鉴定符合2005版中国药典对赤芍的要求。饮片厚度小于6mm6。参考中国药典2005版的测定方法对药材中芍药苷的含量进行了分析，结果为5.2%（wt）。1.2实验试剂 正丁醇（AR，杭州大方化学试剂厂）。芍药苷对照品：中国药品生物制品检定所。硅胶：100-200目，青岛海洋化工厂分厂甲醇（色谱纯，merck公司）石油醚、甲醇等其它有机溶剂均为分析纯。D201大孔吸附树脂1.3实验仪器Agilent1100高效液相色谱仪（含G1354A四元梯度洗脱泵；G1322A在线脱气装置；G1313A自动进样器，UV-Vis检测器，G1316A柱温箱），Aginlent1100色谱工作站；Diamonsil C18柱（250×4.6mm，5m；Dikma）电子分析天平（梅特勒. 托利多仪器上海有限公司）架盘药物天平：马头牌BP-II型，称量范围0.5g-500g，上海医用激光仪器厂。蛇形冷凝管加热套：TC-15套式恒温器，控温范围50-200，浙江新医疗器械厂。500mL圆底烧瓶；50mL容量瓶；1000mL的分液漏斗旋转蒸发仪1.4 实验方法1.4.1分析方法1.4.1.1 TLC定性方法硅胶GF254板，以氯仿-甲醇（5:1）为展开剂，紫外显色（254nm），芍药苷的比移值Rf为0.36。1.4.1.2 HPLC定量 色谱条件：色谱柱为Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6mm，5m，迪马公司），流动相为甲醇:水（40:60），流速1.0mL/min，柱温30，检测UV 230nm7,8。芍药苷的典型HPLC分析结果如图1.1所示。芍药苷图1.1芍药苷的典型HPLC分析结果对照品溶液的配制：精确称取9.4mg芍药甙对照品，置于50mL容量瓶，用甲醇稀释到刻度，得到0.188mg/mL芍药甙对照品溶液9,10。线性关系考察：将配置好的芍药苷对照品溶液依次进样2，4，8，12，16，20L，芍药苷的回归方程为Y6.4368+1370.4773X，r=0.9999，其中X为进样量（g），Y为峰面积（mAUs）。结果表明芍药苷在0.3763.76g呈良好的线形关系。1.4.2提取工艺流程采用的工艺路线如图1.2所示，本工艺主要包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱层析等工序，其中柱层析是本工艺的关键。赤芍饮片醇水溶液回流提取真空浓缩T60液液分配真空浓缩T60柱层析真空浓缩T50芍药苷产品图1.2 芍药苷提取工艺路线1.4.3 提取和纯化方法赤芍饮片700g（芍药苷含量为5.2%）用70%乙醇回流提取3次，每次的溶剂用量分别为4100mL、3500mL和3500mL，回流时间分别为2.0h、1.5h和1.5h。合并提取液，过滤，滤液在60以下真空浓缩至糖浆状的浸膏，称重后分析芍药苷含量。将浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂依次萃取11。每次500mL。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2次，每次500mL。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500mL，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空浓缩得膏状物称重，并分析膏状物中的芍药苷的含量。提取后的膏状物分别用DA-201大孔吸附树脂、D-101大孔吸附树脂、硅胶柱层析进行芍药苷的纯化工艺研究。对DA-201大孔吸附树脂的具体纯化方法如下：采用内径19.8mm的自制层析柱，床层高度39cm。正丁醇萃取所得的膏状物配成0.396g/mL的水溶液，上样10mL，用水作洗脱剂洗脱，分瓶收集流出液，用TLC定性，合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体称重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍药苷的纯度和回收率。对D-101大孔吸附树脂的具体纯化方法如下：柱内径19.8mm，床层高度39cm。正丁醇萃取所得的膏状物配成0.396g/mL的水溶液，上样10mL，分瓶收集流出液，用TLC定性。分别考察20%、30%、95%的乙醇洗脱对分离的影响，在加不同浓度的乙醇前，先用蒸馏水洗至洗脱液的芍药苷的显色反应成无色。测定洗脱液中的芍药苷的含量并合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体称重，用甲醇溶解，采用HPLC定量分析芍药苷的纯度和回收率。对硅胶柱层析的具体纯化方法如下：采用内径30mm的自制层析柱，床层高度555mm（床层体积392mL）。操作过程如下：硅胶用氯仿充分浸泡，脱气后，用湿法装柱。每克正丁醇萃取所得的膏状物用10mL洗脱剂溶解后上柱，再用洗脱剂洗脱（氯仿-甲醇混合溶液），分瓶收集流出液，用TLC定性，合并含芍药苷的部分，减压浓缩至干，称量后用甲醇溶解，经HPLC定量分析。2 结果与分析2.1回流提取过程中的芍药苷提取情况700g赤芍饮片提取得到的糖浆状浸膏共297.8g。经HPLC分析，浸膏中芍药苷的含量为11.9%。回流提取工艺芍药苷的回收率为98.2%，可见采用70%乙醇回流提取3次能把赤芍中的芍药苷基本提取完全。2.2萃取过程中的芍药苷提取情况液液分配的目的是将浸膏中的部分杂质除去，使芍药苷得到初步纯化。液液分配的关键在于选用合适的溶剂。采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，最后用正丁醇萃取浓缩后得膏状物106.6g。经HPLC分析，正丁醇萃取所得膏状物中芍药苷的含量为31.6%。萃取过程中芍药苷的回收率为95.3%。经过液液萃取后可使芍药苷的含量由11.9%提高到31.6%，且芍药苷的损失只有4.7。2.3纯化过程中的芍药苷情况2.3.1 DA-201大孔吸附树脂的纯化情况DA-201大孔吸附树脂的纯化结果见表2.1。合并含芍药苷的39瓶收集部分，减压浓缩至干得到浅黄色固体1.929g，用甲醇溶解，经HPLC定量分析，芍药苷的纯度为58.8%，回收率90.5%。由此可见，DA-201大孔吸附树脂对芍药苷的吸附很弱，用水就可以把芍药苷洗脱下来，故DA-201大孔吸附树脂不适宜作分离高纯度芍药苷的固定相。表2.1 DA-201用水洗脱的洗脱液体积和颜色表瓶 号12345678910体积（mL）45422825353531393734芍药苷检测无无有有有有有有有无2.3.2 D-101大孔吸附树脂的纯化情况采用不同浓度的乙醇进行洗脱，D-101大孔吸附树脂的纯化结果见图2.1，流动相组成对柱层析分离过程的影响如表2.2所示，表中洗脱体积为芍药苷全部洗脱出时收集到的洗脱液的体积（不包括开始用水冲洗的体积）。从表2.2可见，随着乙醇浓度的增加，芍药苷纯度和洗脱体积显著下降，回收率增加。但即使采用20%乙醇洗脱，产品纯度也只有80.0%。D-101的纯化效果也不是很理想。图2.1 不同乙醇浓度的洗脱曲线表2.2 乙醇浓度对柱层析分离过程的影响乙醇浓度20%30%95%纯 度80.0%62.2%52.7%回 收 率91.2%96.6%99.1%洗脱体积（mL）7113742172.3.3 硅胶的纯化情况从表2.3可见，随着流动相中甲醇含量的增加，产品纯度和洗脱体积显著下降，产品回收率增加。当氯仿-甲醇体积比为8:1时，既能保证一次性过柱产品纯度大于97.0%，又能达到使用较少洗脱液的目的（约为4.7个床层体积）。表2.3流动相组成对柱层析分离过程的影响氯仿-甲醇(体积比)10:18:16:14:1纯 度98.0%97.6%93.0%91.7%回 收 率92.3%93.0%96.4%99.8%洗脱体积（mL）294318531560734在流动相氯仿-甲醇体积比8:1下，对负载量对分离结果的影响进行了实验，结果如表2.4所示。从表可见，随着进料量的增加，产品纯度下降，而回收率却显著上升。如果要求通过一次柱层析达到97.0%以上的产品，不能有很高的负载量，合适的负载量为20.7mg/g硅胶。回收率上升的原因可能是硅胶对芍药苷有一定的吸附，每克硅胶的吸附量为一定值，与进样量关系不大引起的。表2.4负载量的优化结果负载量（mg正丁醇浓缩样品/g硅胶）10.320.731.062.0纯 度97.8%97.6%95.9%91.5%回 收 率92.7%93.0%94.5%98.5%3结论本论文提出了一条从赤芍中提取芍药苷的工艺，该工艺包括醇水溶液回流提取、液液分配、柱层析等工序。具体如下：赤芍饮片700g（芍药苷含量为5.2%）用70%乙醇回流提取3次，每次的溶剂用量分别为4100mL、3500mL和3500mL，回流时间分别为2.0h、1.5h和1.5h。合并提取液，过滤，滤液在60以下真空浓缩至糖浆状的浸膏。将浸膏采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂依次萃取。每次500mL。萃取后的水相用乙酸乙酯萃取2次，每次500mL。乙酸乙酯萃取后的水相用正丁醇萃取3次，每次500mL，合并3次萃取的正丁醇溶液，在60以下真空浓缩得膏状物。再将膏状物用硅胶柱层析进行纯化，纯化操作条件为流动相氯仿-甲醇8:1、床层高度与直径比为18.5、负载量为20.7mg/g硅胶。使用该工艺可从赤芍中得到纯度大于97.0%的芍药苷产品，总回收率超过87.0%。4 展望利用二次（或多次）柱层析和增加负载量等措施，有可能进一步降低柱层析的成本。通过多次柱层析可制备纯度大于99.0%的芍药苷产品。参考文献1 国家药典委员会. 中国药典, 部S. 北京: 化学工业出版社, 2000: 125. 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