南岳捕食线虫真菌的分离与培养 毕业论文.docx

南岳捕食线虫真菌的分离与培养 摘要：从衡阳南岳采集土样30份，在水琼脂平板上用全齿复活线虫作为诱饵对土样进行了捕食线虫真菌的分离，并对其进行鉴定。结果表明，南岳土样中捕食线虫真菌主要为节丛孢属（Arthrobotrys）和单顶孢霉属（Monacrosporim）中的种。其中，在节丛孢属中，尤其以寡孢丛孢菌（A. oligospora）的检出率最高，检出率为26.7%；在单顶孢属中，尤以囊孢单顶孢（M. cystosporim）检出率最高，检出率为30%。关键词：捕食线虫真菌；节丛孢属；单顶孢属；分离与培养 目录1. 引言11.1 捕食线虫真菌21.2 国内外研究动态32. 实验材料与方法42.1 材料42.1.1 样品的采集及保存42.1.2 诱饵线虫42.1.3 培养基及试剂52.2 方法52.2.1 捕食线虫真菌的分离52.2.2 分离方法52.2.3 捕食线虫真菌的鉴定62.2.4 数据处理63. 实验结果63.1 各捕食线虫真菌种的形态描述63.1.1 葡萄串状节丛孢(Arthrobotrys arthrobotryides)63.3.2 少孢节丛孢(A. oligospora)73.3.3 弯孢节丛孢(A. musiformis)73.3.4 强力节丛孢(A. robusta)73.3.5 柱捕单顶孢(Monacrosporim cionpagm)83.3.6 囊孢单顶孢(M. cystosporim)83.3.7 厚皮单顶孢(M. eudermatm)83.3.8 网捕单顶孢(M. reticulatm)83.3.9 中华单顶孢(M. sinense)83.2 各种捕食线虫真菌的检出率94. 讨论10致谢11参考文献121. 引言线虫病对畜牧业生产的危害极大，不少线虫病还是人畜共患病，对人类的健康造成了巨大的威胁。植物寄生线虫是一类重要的植物病原生物，在世界范围内普遍发生的植物病害，全球每年因线虫造成的损失达1000亿美元1。目前的主要防治方法仍靠化学药物，虽有一定效果，但化学药物引起的抗药性、药物残留和环境污染等问题日趋严重，已引起越来越多的关注。随着人们对食品安全和环境意识的提高，化学杀线虫制剂的应用必将逐步受到限制，因此，对线虫的生物防治研究自然成为寄生性线虫控制的主要发展方向。生物防治是从整体生态角度出发，按照有害生物的种群和环境相互的原理，充分发挥自然控制因素的作用，将有害生物控制在经济允许的危害水平以下，以获得最佳的经济、生态和社会效益。随着生物防治逐渐被科学工作者所重视，并进行了大量的工作，从而明确了捕食线虫真菌在线虫防治中的重要作用2。捕食线虫真菌是植物病原线虫的一类捕食性天敌，以营养菌丝特化成粘性网、粘性球、非收缩环、收缩环、粘性菌丝、粘性分枝、冠囊体等捕食器官捕捉线虫3。捕食线虫真菌广泛分布于自然界潮湿的土壤、粪便及枯枝落叶等有机物中，一般以腐生菌状态存在；遇到线虫时则发挥其捕食功能,营寄虫生活或作为腐生生活的一种补充。通常营养要求不同。在不同地区、不同植被条件下，优势菌种不同，土壤的性质、有机质含量pH值、温度、湿度、光照、其他微生物种群及线虫数量和活力都对其的分布与存在有一定影响4。捕食线虫性真菌无论在种类上还是在生防效益上均占据极大地优势，研究捕食线虫真菌不仅能有效治理虫害，保护环境，还能节约化学药物的经济损失，对人类具有重要意义，其生物防治前景也被许多线虫防治研究者所认可，也越来越多的被各个国家和地区所重视。捕食线虫真菌的广泛分布，全世界均有报道，甚至在南极5、热泉6、重金属污染区等极端环境中也有分布，它具有极大地发展空间和潜在的市场价值。利用捕食线虫性真菌控制线虫病，首先要从自然界分离培养出适合本地区自然环境条件下的捕食线虫性真菌菌株，了解捕食线虫性真菌的生存环境及所需条件,调查掌握这种宝贵的生物资源在我国的分布状况及分布规律,这是研究捕食线虫性真菌生物防治线虫病的基础和前提条件。过去在这方面的工作，国内外资料不多。特别是国内，关于捕食线虫性真菌的研究还刚刚起步，对这类真菌在自然界的分布情况、种类、所处环境很不清楚，对各种菌株的形态学知识、种属鉴定更是知之甚少。分离培养适合于本地区自然环境条件下的捕食线虫性真菌菌株从许多国外的研究资料中可以看出是非常重要，因为同一捕食线虫性真菌在不同地区可能存在着菌株的差异。而且只有来源于本地区的菌株，将来才可能在本地区生产实际中应用，从国外或其他地区引入菌株。就目前知识而言，还难以预测其将来在生态学方面可能产生的问题，而且在引入时，还存在着检疫、海关等多方面复杂的手续问题。所以，分离培养适合本地区气候条件的捕食线虫性真菌是完全必要的。我国在生物防制动物寄生虫方面，刚刚起步。寄生虫病防治中，盲目用药、效率低下情况比比皆是。抗药性问题、药物残留问题、对环境的污染问题远比国外严重。我国应投入必要的财力、物力、人力对此进行研究。近年，内蒙古农业大学、华中农业大学、中国农业大学在这方面率先做了某些工作，但仍须继续努力。中国已经加入世贸组织，绿色贸易壁垒将是阻碍出口的最大难题。因此，建立有机动物性食品基地，发展无公害农业或生态农业，跟上发达国家的前进步伐，实行可持续发展战略是我们的当务之急。地处衡阳的南岳衡山是我国有名的旅游胜地，生境独特而复杂，生物资源丰富。本文主要是对南岳地区捕食线虫真菌的种类进行初步调查研究，通过对南岳捕食线虫真菌的分离和鉴定，得出南岳地区捕食线虫真菌的种类和优势种群，为应对线虫在植物开展生物防治提供资源储备，也为南岳地区寄生线虫真菌生物防治的深入研究打下基础。1.1 捕食线虫真菌捕食线虫真菌是指以营养菌丝特化形成的粘性菌丝、粘性分枝、粘性球、粘性网、非收缩环、收缩环及冠囊体等捕食器官捕捉线虫的真菌(图1)7。目前，被大多数学者承认的捕食线虫丝孢菌涉及泡囊虫霉属 Cystopage Drechsler、梗虫霉属Stylopage Drechsler、轮虫霉属Zoophagus Sommerst、三角粽孢属Triposporina H hnel、三叉孢属Tridentaria Preuss、毒虫霉属Nematoctonus Drechsler、丝霉属Hyphoderma Wallr.、亚侧耳属Hohenbuehelia Schulzer、圆盘菌属Orbilia Fr.、节丛孢属Arthrobotrys Corda、德氏霉属Drechslerella Subram.、亚隔指孢属Dactylellina M. Morelet、隔指孢属Dactylella Grove和单顶孢属Monacrosporim Oudem等多个属，共涉及接合菌门、子囊菌门、担子菌门和半知菌类的380余个物种，我国已报道的种类约有140种。其中接合菌门3属8种，担子菌门2属27种，其余多集中在半知菌类丝孢纲丝孢目丛梗孢科。迄今为止，据国际真菌权威数据库MycoBank记载，全世界已报道的捕食线虫丝孢菌有347种。在我国，自上世纪80年代以来，国内多位学者报道的捕食线虫丝孢菌104种，其中新种为73个。捕食线虫真菌在世界范围内广泛分布，存在于各种生态环境中，包括农田土壤、园林土壤、森林土壤等，凡有线虫的地方就可能有食线虫真菌存在，捕食线虫真菌是自然界中控制线虫数量变化的重要生物因子，在动植物线虫及食用菌线虫的生物防治中起着非常重要的作用。图1 捕食器官的形态A，B：三维菌网；C，D：收缩环；E：粘球和非收缩环；F：粘性分枝（来源于张颖-食线虫真菌资源研究概况）。1.2 国内外研究动态捕食线虫性真菌在自然界中广泛存在，它们大都生长在腐烂的树叶、木材、苔藓、腐植质土壤及动物粪便中。对捕食线虫真菌的研究已有100多年的历史，国外学者在这方面的研究起步较早。在1809年他们首先发现了多孢节丛孢新种8，1852年又报道了另一新种即少孢节丛孢9。但是这两种新种在当时均被当作腐生真菌而描述的。虽然在1870年报道了少孢节丛孢可产生菌网，但没有发现菌网具有捕食线虫的作用。少孢节丛孢菌是广布性种，最早是从瑞典花园土壤中分出,有Fresenius(1850)描述并命名10。1870年，Woronin发现其可形成有菌环构成的三维立体性菌网11。1888年，德国科学家Zopf观察到了该菌捕食线虫的现象，从而开创了捕食线虫真菌的研究史12。少孢节丛孢菌是各国生物学家、寄生虫学家研究最多的一个捕食线虫性真菌种类、但它可能存在株的区别，各国、各地区分离出的不同株在生物学特性上表现有所差异13。捕食线虫真菌在世界范围内广泛分布，存在于各种生态环境中，包括农田土壤、园林土壤、森林土壤等，凡有线虫的地方就可能有食线虫真菌存在，捕食线虫真菌是自然界中控制线虫数量变化的重要生物因子，在动植物线虫及食用菌线虫的生物防治中起着非常重要的作用。近10多年来，发达国家竞相开展用捕食线虫性真菌对寄生虫病进行生物控制的研究。丹麦皇家兽医大学Peter Nansen教授领导下的实验室在利用捕食线虫性真菌控制家畜线虫感染方面取得了很大进展,引起了国际寄生虫学界的关注。为此，丹麦政府在该大学设立了“动物生物技术研究中心”、“实验寄生虫学中心”，并投入大量经费支持研究工作。他们已在若干国家和地区（澳洲、欧洲、非洲、美洲等）进行了捕食线虫性真菌的分离鉴定，进行了生物学特性研究14。丹麦Christian Hansen生物科学公司(CHBS)与其合作，已申报了专利，并初步进行了商品化开发，现正在进行推广试验。其他一些国家的科学家也在积极从事捕食线虫性真菌的实际开发利用研究(Araujo et. al，2000)15。此外，我国学者从全国28个省市采集千余份土样，分离鉴定出我国捕食线虫真菌及其相关种8属60余种16，其中描述新种17个，即贵州节丛孢、秀丽节丛孢、蛾卵型节丛孢、细脱隔指孢、北京隔指孢、棒状隔指孢、中间隔指孢、分枝隔指孢、云南隔指孢、细镰孢隔指孢、贵州单顶孢、长梗单顶孢、裘氏单顶孢等；新组合种15个；我国新纪录种35个，发现并报道的种类达世界已知种类总数一半以上，初步明确了我国捕食线虫真菌的种类及分布17。迄今为止，全世界报道的捕食线虫真菌约600余种18，但是还有更多的未知种类尚待发掘，而幅员辽阔、地形复杂、气候多变的我国很多地区尚未调查，其中南岳就是未调查的地区之一，这类宝贵真菌资源急待开发利用。因此，对南岳捕食线虫真菌进行调查是十分必要的，对捕食线虫真菌资源的调查及开发利用都有重要科研和应用价值。2. 实验材料与方法 2.1 材料2.1.1 样品的采集及保存采集南岳山上感染根结线虫的植株根样、根围土样及未感染根结线虫的植株根围土。取土样时将表层干土去除，取0-20cm层的土壤，将大约500克土样装入封口塑料袋中，并标记好采集时间、地点、寄主、土壤类型等。样品采集后要及时处理。室温下3周内应处理完，在4时可延长至9周（李天飞等，2000）。2.1.2 诱饵线虫诱饵线虫用Panagrellus redivius ,中科院微生物研究所刘杏忠研究员提供。2.1.3 培养基及试剂燕麦片培养基用电子天平称量新鲜的燕麦片10g加入到干净的三角瓶中，再加入自来水30g,混匀之后将三角瓶用棉塞塞好，用牛皮纸将瓶口包好用棉线系紧，然后放入高压灭菌锅内，在121下灭菌 20min，冷却后用于培养诱饵线虫。 水琼脂培养基（简称：WA）用电子天平称量琼脂粉2.5g加入到干净的三角瓶中，再加入自来水150ml混匀之后将三角瓶用棉塞塞紧，用牛皮纸将瓶口包好，然后放入高压灭菌锅内，在121下灭菌 20min，冷却后用于保存用于制备平板撒土分离培养基。马铃薯葡萄糖琼胶培养基（PDA）A、天平称量去皮马铃薯块200g切碎，装入一个2000ml的大烧杯中，加入1000ml的水，煮沸30分钟，然后用双层纱布过滤去除滤渣。B、称取琼脂粉15g，葡萄糖20g加入到滤液中，然后加水补足1000ml继续加热，直到琼脂融化。C、分装入6个250ml的三角瓶中，用棉塞塞好，用牛皮纸包紧放入高压灭菌锅内，在121下灭菌 20min，保存待用。主要试剂：靑霉素，硫酸链霉素。2.2 方法2.2.1 捕食线虫真菌的分离捕食线虫真菌的分离与鉴定都是用水琼脂培养基，培养线虫用燕麦片培养基，诱饵线虫为全齿复活线虫（Panagrellus redivivus）。2.2.2 分离方法土样的分离，诱饵平板法，在加有“双抗”（ 靑霉素50ppm，硫酸链霉素100ppm）WA平板上撒入0.5-1.0g土样，接入5000条诱饵线虫（Panagrellus redivius）（李天飞等，2000）。在操作时应注意土样最好是撒在皿中央，使周围留出1cm宽的带或将土撒成带状，这样可使食线虫菌物生长至无土带便于观察。培养一周后开始观察，在解剖镜或显微镜下对每个平板进行全面镜检，一旦发现有捕食线虫真菌的分生孢子，和其它寄生真菌等的分生孢子，取解剖针置于酒精灯上灼烧灭菌，并插入PDA平板中冷却，然后用解剖针粘取或挑取单个分生孢子或菌丝，接种到PDA平板上，标记分离编号及日期等。2.2.3 捕食线虫真菌的鉴定菌株的鉴定：将保存的菌株挑入CMA平板，在培养过程中对培养物的菌落特征、菌丝形态、分生孢子形态及其大小、产孢方式、后垣孢子形态、捕食器等进行观察、描绘、拍照，然后进行形态分类鉴定。玻片培养：参照Liu et al.方法，在菌落边缘切取0.5cm×0.5cm的菌种块置于无菌载玻片上，菌丝可以面朝上或面朝下，然后加盖无菌的盖玻片，最后放入50cm的无菌塑料离心管内置于25恒温箱内进行培养（离心管的内径应恰好能把玻片卡住）。捕食器官的诱导：捕食器官的诱导方法是在上述玻片培养方法的基础上加以改进而来的，即参照Liu et al.方法，先在菌丝块上加入少许线虫，再盖上盖玻片，然后放入50cm的无菌塑料离心管内置于25恒温箱内进行培养。待菌丝长好后，取另一块洁净的载玻片，在上面滴加一滴水，最后将培养好的盖玻片盖上即可观察和拍照。如果要制成永久玻片，则以乳酚油代替水滴加在洁净的载玻片上，制好后再用中性树脂密封就可以了。原培养的载玻片取出菌种块后也可以用于制片观察。对于用盖玻片培养不能产生捕食器官的菌种，可以参考高仁恒等49方法在平板上加入线虫，再进行诱导一次。2.2.4 数据处理检出率=该菌出现的样品数总样品数×100%；总检出率=各菌检出率之和计算出现频率，统计物种丰富度。3. 实验结果3.1 各捕食线虫真菌种的形态描述3.1.1 葡萄串状节丛孢(Arthrobotrys arthrobotryides)该菌分生孢子梗具瘤节，向顶端渐细，长为265403m，基部宽为79m，瘤节较紧密地排列在孢子梗顶部。分生孢子梨形，双细胞，其大小为1722×812m，无厚垣孢子，产生三维菌网。3.3.2 少孢节丛孢(A. oligospora)该菌分生孢子梗直立，具瘤节不分枝，梗长180470×88.7ìm，每瘤节孢子数1016个，分生孢子倒卵形，双细胞，其大小为2130×1114m，产生厚垣孢子及三维菌网(图2) 。图2 少孢节丛孢A.分生孢子；B.分生孢子梗；C.菌丝及菌网；D.厚垣孢子3.3.3 弯孢节丛孢(A. musiformis)该菌分生孢子梗直立不分枝，孢子梗基部粗，向顶端渐细，梗长160320ìm，宽4.88ìm，顶端宽2.43.2ìm，孢子梗顶端具小齿，梗顶着生25个分生孢子。分生孢子倒卵形，双细胞，其大小为2842×69ìm，产生厚垣孢子及三维菌网。3.3.4 强力节丛孢(A. robusta)该菌分生孢子梗直立，分枝有瘤节，每瘤节出着生26个孢子，孢子梗长96304m，宽23m。分生孢子倒卵形，双细胞，其大小为1826×811m，未见厚垣孢子，产生三维菌网。 3.3.5 柱捕单顶孢(Monacrosporim cionpagm)该菌分生孢子梗直立，长88260m，宽为23m，梗顶端着生1个菱形孢子，顶园，基部顿。分生孢子有24个分隔，多为34个分隔，其大小为4250×1416m。未见厚垣孢子，产生粘性分枝。3.3.6 囊孢单顶孢(M. cystosporim)该菌分生孢子梗直立，梗的基部比顶端稍粗，孢子梗长56 210m，宽23m,孢子梗顶端着生1个纺锤形的分生孢子。分生孢子大小为3446×1420m,具23个分隔。产生厚垣孢子及三维菌网（图4）。 图4 囊孢单顶孢：A.分生孢子；B.菌丝及菌网3.3.7 厚皮单顶孢(M. eudermatm)该菌分生孢子梗直立，细长，去膝状，层出。分生孢子纺锤形，3个分隔，其大小3440×1519m，产生厚垣孢子及三维菌网。3.3.8 网捕单顶孢(M. reticulatm)该菌分生孢子梗直立，孢子梗长156276m，宽1.22.4m，孢子梗顶端着生1个分生孢子。分生孢子呈椭圆形，其大小为5769×1720m，孢子具4个分隔。未见厚垣孢子，产生三维菌网。3.3.9 中华单顶孢(M. sinense)该菌分生孢子梗直立，孢子梗基部比顶端宽，孢子梗长139372m，梗基宽4.87m，梗顶宽2.02.4m，孢子梗顶端着生1个纺锤体的分生孢子。分生孢子大小为2732×1517m，产生厚垣孢子及三维菌网。3.2 各种捕食线虫真菌的检出率从衡阳南岳采集的30份土样中经培养分离、纯化鉴定，分离出2属9种捕食线虫真菌，各种捕食线虫真菌的检出率如表1。表1 岳捕食线虫真菌的分离数、占总株数比率及检出率种类分离数（株）占总株数比 率（%） 检出率（%）节丛孢属(Arthrobotrys)2341.1葡萄串状节丛 (A. arthrobotryides)58.916.7少孢节丛孢(A. oligospora)814.226.7弯孢节丛孢(A. musiformis)712.523.3强力节丛孢(A. robusta)35.310单顶孢属(Monacrosporium）4158.9柱捕单顶孢(Monacrosporium cionpagum)610.7 20囊孢单顶孢(M. cystosporium)916.130厚皮单顶孢(M. eudermatum)814.2 26.7网捕单顶孢(M. reticulatum)712.5 23.3中华单顶孢(M. sinense) 58.9 16.74. 讨论本实验所分离鉴定的捕食性真菌，主要为节丛孢属（Arthrobotrys）和单顶孢霉属（Monacrosporim）中的种，说明节丛孢属和单顶孢属可能是南岳地区捕食线虫真菌中的重要类群。在节丛孢属中，尤其以少孢从孢菌（A. oligospora），在不同土样中的检出率最高，检出率为26.7%；在单顶孢属中，尤以囊孢单顶孢（M. cystosporim）检出率最高，检出率为30%。这跟张克勤等所得到的结果是相似的19-20。因为该这两种菌存在不同的土样中，说明其适应范围较广，能够存在于不同的生态环境中，具有较强的适应能力，可能在线虫的生物防治上具有较大的意义。 但是，由于采集的土样较少，分离的土样少；采样时间急促，没有分好季节采样，仅限于3月份；以及实验时间也较短等原因，本实验所分离等到的菌种较少，也没有分离到新的菌株，因此尚需要更加系统的采样对南岳地区的捕食线虫真菌进行进一步的调查与研究。致谢在本文的撰写过程中，李玉中老师作为我的指导老师，他治学严谨，学识渊博，视野广阔，为我营造了一种良好的学术氛围。置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，树立了明确的学术目标，领会了基本的思考方式，掌握了通用的研究方法，而且还明白了许多待人接物与为人处世的道理。其严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力，与无微不至、感人至深的人文关怀，令人如沐春风，倍感温馨。正是由于他在百忙之中多次审阅全文，对细节进行修改，并为本文的撰写提供了许多中肯而且宝贵的意见，本文才得以成型。衷心感谢李玉中老师！参考文献1 Sasser J N, D W Freekman. 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Then, nematode-trapping fungi were isolated by Panagrellus redivivus as bait on water agar flat and identified by Morphological characteristics. The results showed that the nematode-trapping fungi were the species of Arthrobotrys and Monacrosporim in soil samples. Especially A. oligospora and M. cystosporim were the highest detection. Their detection rate is 26.7% and 30%.Keywords: Nematode-trapping fungi; Arthrobotrys; Monacrosporim; Isolation and cultivation