毕业论文-多孔陶粒吸附微生物的研究.doc

湖北大学毕业论文（设计）目 录1 多孔陶粒吸附微生物的研究进展51.1多孔陶粒吸附微生物的发展史51.2多孔陶粒吸附微生物的研究目的51.3多孔陶粒吸附微生物的研究意义62 材料与方法62.1 实验材料62.2 实验方法62.3 三种不同孔径的陶粒吸附恶臭假单胞菌的效果比较62. 4陶粒固定重组菌的条件优化72.5 表征陶粒吸附微生物效果的测定方法的比较72.6 扫描电镜样品的制备73 结果及分析83.1三种不同孔径的陶粒吸附恶臭假单胞菌的效果比较83.2 陶粒固定重组菌的条件优化93.3表征陶粒吸附微生物效果的测定方法的比较103.4扫描电镜样品的制备104 讨论与小结11参考文献12摘 要 运用固定化微生物方法中的吸附法，将恶臭假单胞菌固定在三种不同孔径大小的生物陶粒表面，根据影响固定效果的条件进行研究。然后采用正交试验进行重组菌固定化条件的优化，正交试验的最优组合为D2A2C1B1，即固定化最优条件为30，pH为7，菌体浓度大，静置。最后用在最佳条件下制备得到的固定化颗粒进行扫描电镜观察，从而证实我们选用的固定化载体有良好的吸附微生物的性能。本研究对多孔陶粒吸附微生物治理污水的研究具有重要意义，为生活污水处理及回用（包括中水回用），工业废水处理及回用，微污染水源饮用水处理等开辟出更广泛的应用前景。【关键字】 多孔陶粒 吸附法 恶臭假单胞菌 扫描电镜The porous the ceramsite adsorption effect of Pseudomonas putida its adsorption characterizationAbstract The use of immobilized microorganisms in the assay method, the fixed in three different Pseudomonas putida bio-ceramic surface of the pore size, according to the conditions of fixed effects were studied. Then carried out using recombinant orthogonal optimization of immobilization conditions, the optimal combination of orthogonal D2A2C1B1, the optimum conditions for immobilization of 30, pH 7, cell concentration, put it aside. Finally, under the best conditions obtained immobilized preparation for scanning electron microscope, thereby confirming our use of immobilized microorganisms have a good adsorption performance. The adsorption of microorganisms on the porous ceramic of sewage treatment is important, for domestic wastewater treatment and reuse (including water reuse), industrial wastewater treatment and reuse, water treatment and other micro-polluted water to open up wider application.【Key Words】 porous ceramic adsorption Pseudomonas putida scanning electron microscopy绪论 多孔陶瓷材料是在材料成形与烧结的过程中通过控制孔径大小和分布而形成的一类陶瓷产品。由于其共价键和复杂离子键的键合以及复杂的晶体结构而具有耐高温、耐腐蚀、热稳定性好的特点，并且可以通过对其孔隙率和孔径的调节而使之具有良好的表面特性。根据气孔的类型，可以将多孔陶瓷分为开气孔和闭气孔两种，前者的气孔都是相互贯通并与外界环境相连，而后者的则是相互孤立地被封闭在陶瓷体内，在不同的场合它们分别有不同的用途，反过来，多孔陶瓷用途的多异性也对其孔径的变化范围提出了不同的要求。从19世纪60年代初始发展至今，多孔陶瓷就一直倍受生物、环保领域科研人员的青睐，这是因为它作为生物催化剂的载体具有无毒害作用、稳定性优异、传质性能好、机械强度高、生物亲合性好、操作简单、价廉易得等优点，而且，随着多孔陶瓷造孔技术、发泡技术、强度控制技术、孔隙率控制技术、孔径控制技术的发展，以多孔陶瓷作为生物催化剂载体的生物固定化技术将会更加广泛地被应用在生物生产上。生物固定化技术就是用化学或物理的方法将游离细胞定位于材料的限定空间中，并使其保持生物活性且可反复利用的生物技术3。目前被采用得最多的固化方法有：吸附法、包埋法、包络法、共价结合法和交联法。其中包埋法虽然容易操作但会对微生物产生较大的伤害（热伤害、毒物伤害等），它的应用主要还是停留在试验改进阶段，采用后三种方法对微生物的伤害会小些，但固定化载体材料的制造难度较大，其工程应用很受限制。近年来，在纤维素及其衍生物、壳聚糖及其衍生物、凝胶材料、有机合成聚合物等有机高分子材料上进行微生物固定化的科学研究较多，生产效率也大大提高，但实际应用中普遍存在材料再生困难、菌种易老化、成本较高等问题，本文将结合生物固定化方法及其在废水处理工程应用中常见问题来探讨生物固定化载体多孔陶瓷的性能。1 多孔陶粒吸附微生物的研究进展1.1多孔陶粒吸附微生物的发展史随着工农业的迅速发展，水中的有害物质逐年增多，尤其是上世纪60年代以来，不少地区的饮用水水源日益恶化，同时，随着水质分析技术的进步，水源水和饮用水中的微量污染物又不断的被检测出来，这些，都对饮用水的处理提出了新的、更高的要求。重金属废水的常用处理方法有：化学沉淀法、膜分离法法、离子交换树脂法等4。这些方法都不能快速并且廉价的处理金属离子含量小于100mg/L的低浓度的金属废水。生物吸附法是最为新型的一种方法，因为其适用于处理大体积低浓度的重金属废水，并且高效廉价。吸附法是微生物固定方法中最简单的一种方法。吸附法具有制备过程简单，微生物活性保留能力强，固定化成本低，空间阻位小，载体可再生等优点5。常用的固定化载体有：活性炭、多孔陶粒、多孔树脂等。吸附法是依据带电的微生物细胞和载体之间的静电作用，使微生物细胞固定的方法，是传统的固定微生物的方法。不同的微生物有不同的排毒机制，比如有微生物体内富集、生物转化、生物矿化等。由于生物陶粒本身的特点，适合微生物生长，因而用生物陶粒固定化微生物用来处理污水中的金属离子会具有良好的处理效果。1949年，Ruchhoft等人首次提出了生物吸附的概念，他利用活性污泥去除水中的放射性元素239Pu，去除率高达96%，并认为239Pu的去除是由于微生物的繁殖形成具有较大面积的凝胶网，而使微生物具有吸附能力的结果。此后，国外许多研究者对此进行了广泛的研究，陆续发现真菌，藻类，细菌等都具有吸附重金属的能力，都可以用来净化水体。Tsezos和Volesky利用黑曲霉菌（Aspergillus niger）吸附铀和钍6；Niu等发现pH对黄青霉（Penieillium chrysogenum）吸附铅的影响很大，pH在45的范围内，黄霉菌的饱和吸附量比活性炭要高7。Ozer等用少根根霉（Rhizopus arrhizus）除去工业废水中的Fe(II), Pb(II)和Cd(II)离子8。P.K. Wong等9用固定化假单胞菌II-11去除回收工业废水中的铜离子，M.P. Pons等10用固定化假单胞菌菌株EPS 5028提取铀，J.S. Chang等11用灭活的铜绿假单胞菌PU21(Rip64)吸附汞离子均取得了很好的效果。本实验所选用的恶臭假单胞菌经试验证实对铜离子、隔离子、锌离子具有很好的去除能力12,13。目前，国外已经有使用死的微生物制成生物吸附剂去除水中重金属的专利，例如，AMT2 BIOCLAIM工艺就是利用死的芽抱杆菌制成球状生物吸附剂吸水中重金属离子14。在美国已有 2个科研机构研究和提供商业用途的生物吸附剂，一个是以废弃的微生物为对象，另一个是以藻类为对象。1.2多孔陶粒吸附微生物的研究目的 比较孔径大小对生物陶粒固定微生物的影响，从而选出用来固定微生物的最适孔径大小的生物陶粒15,16。 选出陶粒固定恶臭假单胞菌的最佳条件。 通过扫描电镜观察证明生物陶粒的吸附性能。1.3多孔陶粒吸附微生物的研究意义 生物吸附法是最为新型的一种方法，因为其适用于处理大体积低浓度的重金属废水，并且高效廉价17。吸附法具有制备过程简单，微生物活性保留能力强，固定化成本低，空间阻位小，载体可再生等优点。本课题以生物陶粒为固定化载体，并对其固定微生物的条件进行研究，为开发新的固定化材料提供了依据18。 本课题比较了表征生物陶粒吸附微生物效果的测定方法，也为以后能更精确的表达出滤料的固定化效果提供了参考依据19。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 微生物菌株 恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)，系华中农业大学国家农业微生物重点实验室提供.2.1.2 陶粒 火山岩生物滤料20（购于北京淇方天科技有限公司，孔径：0.51mm; 24mm; 46 mm）2.1.3 试剂药品：蛋白胨、酵母膏、氯化钠、均为分析纯.2.1.4 主要实验仪器 722S可见分光光度计（无锡科达仪器厂）、TS-111B恒温培养振荡器（上海科学仪器厂）、FA1004B电子天平（郑州南北仪器设备有限公司）、TLL-C台式冷冻2.2 实验方法2.2.1 恶臭假单胞菌悬液的制备 在文献21的基础上进行改进。配置100 ml LB培养基于 500 ml三角瓶中，于30 恒温摇床上培养24 h ，取出菌悬液并在8000 rpm条件下离心10 min，弃上清液，用20 ml的无菌蒸馏水将菌体打散，使菌悬液的OD600在0.9左右.2.2.2 陶粒的处理 将陶粒浸泡在水中2 h，去杂、洗净后置于白瓷盘中，在110 烘箱中烘4 h，待用.分别用0.2 mol/L的HCl浸泡上述陶粒，24 h后去掉酸液或碱液，蒸馏水洗涤3次，灭菌后待用22.2.3 三种不同孔径的陶粒吸附恶臭假单胞菌的效果比较将调好OD600值的菌悬液分别加入到上述装有滤料的锥形瓶中，放置于37、60r/min的摇床中吸附23。分别间隔一段时间取样，用分光光度计测量残余OD600值，时间间隔如下表1所示：表1 滤料固定假单胞菌取样时间0.5小时0.5小时0.5小时1小时1小时1小时0.51mmA组0.51mm B组24mm A组24mm B组46mm A组46mm B组空白A组空白B组2. 4陶粒固定重组菌的条件优化采用正交试验进行重组菌固定化条件的优化，根据因素水平表2变化陶粒吸附重组菌的环境条件24，其余实验步骤和操作同2.1。表2. 重组菌固定化试验方案因素水平ApHB转速R/rpmC菌体初浓度倍数D温度T/140120271201/3303101/6402.5 表征陶粒吸附微生物效果的测定方法的比较2.5.1 OD600值比较法 按照2.3的方法通过比较OD600测量值的变化来判断其吸附的效果。相对OD600值差越大，其固定化效果越好。2.5.2 细胞干重法 在2.4得出的最佳实验方案的情况下得到的固定化陶粒，用无菌水洗涤三次，收集无菌水菌液，然后8000 rpm离心10min，弃上清液，在100 烘箱恒温加热至恒重。称重，比较其质量。2.6 扫描电镜样品的制备2.6.1 固定化微生物样品的制备25 未经任何处理的洗净陶粒、酸处理陶粒、铁膜陶粒和铝膜陶粒分别吸附恶臭假单胞菌。将陶粒和菌液按30 g：100 ml的比例混匀，于60 r/min 摇床上吸附2 h，取出吸附陶粒，待处理.2.6.2 陶粒吸附菌SEM样品的制备26 将上述吸附菌的陶粒分别用2.5% 戊二醛固定12 2 4 h 蒸馏水清洗3次乙醇梯度脱水，30%、50%、70%、85%、95% 各一次，100% 乙醇2次，1520 min/ 次乙酸异戊酯置换2次，20 min/ 次，最后冷冻干燥，粘台，镀金，电镜观察，同时做一个空白陶粒的电镜观察27,28.2.6.3 游离菌的SEM样品的制备 在2.2.1 恶臭假单胞菌悬液的制备中，菌悬液在8000 r/min条件下离心10 min，弃上清液后，用2.5% 戊二醛固定菌12 24 h弃上清蒸馏水清洗3次，每次用离心机在8000 r/min 离心10 min，其余操作同2.2 . 3 结果及分析3.1三种不同孔径的陶粒吸附恶臭假单胞菌的效果比较 三种不同孔径的陶粒比较的实验结果见下图1和表3：由表3和图一可以看出，孔径对陶粒的吸附效果有很大的影响，在本实验中，最适合吸附恶臭假单胞菌的陶粒为孔径在46 mm之间的陶粒。表3 滤料固定假单胞菌取样时间0.5小时0.5小时0.5小时1小时1小时1小时去除率0.51mmA组0.6900.7030.6880.7710.7180.73419.06%0.51mm B组0.7860.7660.7350.7300.7580.76114.12%24mm A组0.6890.7110.6540.6510.7160.75823.41%24mm B组0.7770.7410.7060.6750.6990.77946mm A组0.7370.7020.7060.6300.6920.71546mm B组0.7650.7020.6730.6940.7220.743空白A组0.9110.9110.8530.8510.8840.919空白B组0.8380.9230.8650.8850.8900.975图1 三种孔径的陶粒对假单胞菌吸附效果结果3.2 陶粒固定重组菌的条件优化研究固定化的最优条件，有助于了解陶粒对重组菌的吸附机理，并为从实验室条件转向实际环境应用提供一定理论基础和参考值。选取相对OD600值差作为各实验组的试验指标，相对OD600值差越大，其固定化效果越好。表4 固定化条件优化试验结果及方差分析 因素实验号ApHB转速R/rpmC菌体初浓度倍数D温度T/相对OD600值差yiyi*1001401200.0141.417241201/3300.0232.321341201/6400.0050.4834701/3400.0242.392571201/620-0.002-0.233671201300.0494.86771001/6300.0151.4758101201400.0000.0179101201/320-0.007-0.683j11.411.762.100.17F0.10（2，）=2.30j22.341.131.342.89j30.270.350.96Rj2.070.631.752.72Sj6.460.252.8611.74Fj1.690.130.753.07i0.10优水平A2B1C1D2主次因素D 、 A 、 C 、 B最优组合D2 A2 C1 B1分析表4，由直观法，分别比较各因素水平所对应的试验指标的平均值jk，可以判断出所选因素的优水平依次是：环境pH为7，转速为0R/rpm，即在静置条件下，菌体初浓度选取较大值，温度为30。比较各因素的极差Rj，可以判断所选因素的主次顺序依次为温度、pH、菌体初浓度和转速，即温度对试验指标的影响最大，转速对其影响最小。由显著性检验分析，只有温度为显著因素。所以可以判断该试验的最优组合为D2A2C1B1，即固定化最优条件为30，pH为7，菌体浓度大，静置。由于细菌的沉降效应随着菌体浓度的增大而增大，并且因素C也不是显著因素，所以在确定菌体初始浓度时，可以灵活选择，一般应选取一个合适的值，而并不是浓度越大，固定化效果越好。值得注意的是，通过正交试验所得的优化条件是最优条件真实值的近似值。在投产应用过程前，还要做进一步的研究分析，而且需依据方便实际操作的原则作出相应调整。3.3表征陶粒吸附微生物效果的测定方法的比较OD600值比较法的实验结果见图2：干重比较法的实验结果见表5：OD600值比较法：图2 2种陶粒的吸附比较细胞干重法：表5 细胞干重法分组吸附细胞的质量0.21mm孔径0.0069 0.0062 0.005546mm 孔径0.0075 0.0065 0.0071可以看出干重法的误差较大，OD600值比较法得到的结果相对而言精准一些。3.4扫描电镜样品的制备图37为实验结果，由图可知，用上述制样方法，真实保持了恶臭假单胞菌的短棒状形态结构（图3），图4显示陶粒是多孔物质。经过酸处理、未处理的陶粒都有比较好的吸附效果（图47），这与2.2的实验结果相一致.43 657图3 游离恶臭假单胞菌形貌；图4空白陶粒的表面形貌；图5 6空白陶粒表面吸附菌形貌；图7 8酸处理陶粒表面吸附菌形貌；4 讨论与小结 通过对固定化的最优条件用正交试验优化分析，有助于了解陶粒对重组菌的吸附机理。选取相对OD600值差作为各实验组的试验指标，相对OD600值差越大，其固定化效果越好。正交试验结果可以判断所选因素的主次顺序依次为温度、pH、菌体初浓度和转速，即温度对试验指标的影响最大，转速对其影响最小。由显著性检验分析，只有温度为显著因素。由于细菌的沉降效应随着菌体浓度的增大而增大，并且因素C也不是显著因素，所以在确定菌体初始浓度时，可以灵活选择，一般应选取一个合适的值，而并不是浓度越大，固定化效果越好。通过电镜扫描观察经过酸处理、未处理的陶粒都有比较好的吸附效果。参考文献1 陈铭，周晓云.固定化细胞技术在有机废水中的应用与前景.水处理技术,1997.23(2):982 R.E.Speece等.工业废水的厌氧生物技术M .中国建筑出版社.2001.3 杨柳燕，肖琳.环境微生物技术. 北京:科学出版社.2003.377.4 朱 亮,张文妍,王占生.生物陶粒滤池预处理黄浦江上游水的生产性试验研究J.河海大学学报.2003,31(4):382385.5 Lautens M, Fagnou K, Yang DQ.Rhodium2catalyzed asymmetric ringopening reaction of oxabicyclic alkenes : application of halide effects in thedevelopment of a general processJ.Am Chem Soc, 2003, 125:14884. 5 欧阳琨等.多孔陶瓷载体固定化酵母的研究.西北轻工业学院学报.1992,9(3):4653. 6 刘文君,贺北平,张锡辉等.生物预处理对受有机污染源水中胶体Zeta电位的影响研究J.中国给水排水,1996,12(4):2729.7 M.P. Pons, M.C. Fuste, Uranium uptake by immobilized cells of Pseudomonas strain EPS 5028J, Appl. Microbiol.Biotechnol.39 (1993)661665.8 陈小霞,梁世中等.固定化小球藻去除Cr6+的研究J.海洋通报,2002.21（5）：32 37.9 张欣华,杨海波.固定化海洋微藻对污水中Ni2+的吸附J.生物技术, 2003 ， 13( 5)：25 27.10 杨芬.固定化藻细胞对水中Cu( II )的吸附研究J.曲靖师专学报, 2000,19 (6)11 林国强,陈新滋,李月明等.手性合成不对称反应及其应用M.北京：科学出版社，2000.156.12 王胜国,于国清,王世文.不对称催化及其在精细化工中的应用J.工业催化,2000,813 曹亚莉,田 沈,赵 军等.固定化微生物细胞技术在废水处理中的应用J.微生物学通报,2003,30(2):7781.14 高桂青,鞠治杰,鞠海燕.改性陶粒的制备及其过滤去除有机物的研究J.安徽农业科学,2009,37(5):2205 2207.15 张文妍,朱 亮,薛红琴.微污染水源生物预处理氨氮去除影响因素探讨J.给水排水，2002,28(11):13.16 郑邦乾，张洁辉固定微生物用聚合物多孔载体的研究J高分子材料科学与工程，1995，35(11):145-14917 齐水冰，罗建中固定化微生物技术处理废水J上海环境科学，2002，44(21):174-17918 刘蕾，李杰，王亚娥生物固定化技术中的包埋材料J净水技术，2005，9.19 陈铭，周晓云.固定化细胞技术在有机废水中的应用与前景J.水处理技术，1997，12.20 朱时珍，赵振波.多孔陶瓷材料的制备技术J.材料科学与工程，1996，24(4).21 Kenji Kida ,et . ,The Importance of the Surface Charge on Support Media for Microbial Adhesion ,J Ferment Bioeng , 1992.73 :323325. 22 张景强，朴英杰，蔡福筹等生物电子显微技术M 第一版，广州，中山大学出版社，1987，11313223 应国华，李向印，李淑荣等扫描电镜生物样品的盐酸化学消化法J中华物理医学杂志，1988，10(2)，10210314