氯霉素药物分析方法的研究 毕业论文.doc

摘要在p为10.6711.58的条件下, 氯霉素与茜素红反应生成玫瑰红色离子缔合物，最大显色波长位于474nm，线性范围为0.310.8 mg/L，摩尔吸光系数为1.11×104L/（molcm），氯霉素在一定的浓度范围内遵从朗伯-比尔定律，由此建立了测定氯霉素的分光光度法，并探讨了适宜的反应条件、主要分析化学性质及络合比，最后进行了氯霉素的样品分析及加标回收实验。该法用于市售药物中氯霉素含量的测定，结果令人满意。关键词：氯霉素茜素红分光光度法乙醇 AbstractThe pH of 10.6711.58conditions, the generation of chloramphenicol and alizarin red roses red-association complex, the largest color wavelength at 474 nm, the range of 0.3 10.8 mg / L, molar absorption coefficient : 1.11 × 104L / (mol cm), the concentration of chloramphenicol in a certain area to comply with Lambert - Beer's law, which established the determination of chloramphenicol spectrophotometry, and to explore its optimum conditions, the main chemical analysis Nature and complex than the end of a sample analysis of chloramphenicol and the standard addition of recovery; the law for commercial drug chloramphenicol in the determination of satisfactory results.Key words:Chloramphenicol, alizarin red, spectrophotometry, ethanol1 引 言氯霉素(Chloramp henicol ,CAP) 为白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末, 味苦, 易溶于甲醇、乙醇、丙酮, 微溶于水, 干燥时稳定, 其2.5% 水溶液的酸碱度为4.57.5,在弱酸性和中性溶液中较稳定, 煮沸不分解, 遇碱类物质失效, 熔点为149153 。其结构式为（图1）： 图1氯霉素的结构式它是第一个化学人工合成的抗生素, 是一种有效的广谱抗生素,能抑制细菌蛋白质的合成，但对革兰氏阴性菌较强。对各种立克氏体、原虫及部分病毒也有一定的抑制作用。由于价廉及其优良的抗菌性、稳定的药性,曾在一段时间内作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药,特别是在水产品中。但氯霉素存在严重的毒副作用,易引起人体血中毒, 能抑制人体骨髓造血功能,导致不可逆的再生障碍性贫血、引起粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症等疾病,低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性,。长期微量摄入氯霉素不仅使沙门氏菌、大肠杆菌产生耐药性, 而且还会引起机体正常菌群失调, 使人类易患各种疾病。另外氯霉素还可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。氯霉素在动物体内的残留, 通过肉、蛋、奶等传递给人类, 对人体危害极大。动物食品中氯霉素残留对人类健康构成的潜在危害已被越来越多的人认识。因此,我国已禁止在渔牧养殖中使用氯霉素,并加强了对动物源性食品中氯霉素残留的检测力度。美国仅允许氯霉素用于非食用动物, 规定在动物食品中不得检出氯霉素。欧共体不允许氯霉素用于产奶母牛和产蛋鸡, 在其他动物的使用上也有限制, 并严格规定肉中的氯霉素残留量不得超过0.1ug/Kg。为了保障人民的健康及扩大食品的贸易往来, 建立灵敏度高, 特异性强, 简便易行的动物性食品中氯霉素残留的检测方法是非常必要的。目前对氯霉素的分析方法主要有以下几种：气相色谱法1-3、液相色谱法4-6、薄层色谱法7、放射性分析法8-9、微生物法10及免疫学检测法11-12等。德国Russel 首先报道了液相色谱法检测氯霉素的残留，Arnold 和Somogyl 建立了放射免疫分析试验方法, Camphell 等建立了酶联免疫吸附测定法11-14。另外还有人采用单克隆抗体竞争性酶联免疫法测定猪肌肉组织中氯霉素残留, 检测限为25ugmL。更灵敏的亲合素-生物素酶联免疫吸附测定法也已成功建立，检测限达10ug/kg。目前已有测定氯霉素的试剂盒, 如EM IT 试剂盒,Lacar-Test试剂盒。本实验利用易于普及的紫外-可见分光光度计，采用茜素红可见分光光度法测定氯霉素的含量。研究发现，在pH 11.41的条件下，氯霉素与茜素红反应生成具有正吸收的玫瑰红色络合物，最大正吸收波长位于474nm，线性范围为0.310.8 mg/L，氯霉素在一定的浓度范围内，遵从朗伯-比尔定律，因此建立了测定氯霉素的光度分析法，并探讨了适宜的反应条件、主要分析化学性质及络合比。该法用于市售药物中氯霉素含量的测定，效果良好。2 实验部分 2.1 仪器和试剂 UV-3010型紫外-可见近红外分光光度计（天美公司，香港）；T6新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Seveneasy型实验室酸度计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。氯霉素(Chloramp henicol，CAP；长江师范学院分析测试中心提供)标准溶液：储备液浓度1.0×10-3mol/L,操作液浓度1.0×10-4mol/L。茜素红(alizarin red，ALR；四川隆昌化学试剂厂)的水溶液：1.0×10-3mol/L，1.0×10-4mol/L。BR缓冲溶液：0.4mol/L H3PO4、H3BO3和HAc与0.2 mol/LNaOH溶液按一定比例混合，用Seveneasy型实验室酸度计检测配成一系列不同pH值的缓冲溶液。HAc-NaAc缓冲溶液：0.2 mol/L NaAc溶液与0.2 mol/LHAc溶液按一定比例混合，用Seveneasy型实验室酸度计检测配成一系列不同pH值的缓冲溶液。Tris-HCl缓冲溶液：0.2 mol/L Tris溶液与0.2 mol/L HCl溶液按一定比例混合，用Seveneasy型实验室酸度计检测配成一系列不同pH 值的缓冲溶液。表面活性剂：溴化四乙基钠（TBAB）0.5g/L；溴代十六烷基吡啶（TPB）0.5g/L；十二烷基磺酸钠（SDS）10g/L；十二烷基苯磺酸钠 8g/L；溴化四乙基铵(TEAB)1.5g/L；乳化剂（OP）1%；SLS 0.5g/L；溴代十六烷基三甲基钠(TMAB) 0.5g/L。氯霉素为生化试剂，其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。2.2 实验方法 在10 mL比色管中，准确加入0.5 mL pH 11.41的BR缓冲溶液，再依次准确加入2.0mL 1.0×10-3mol/L茜素红溶液和一定量的1.0×10-4mol/L 氯霉素标准溶液，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，15min后，以试剂空白为参比，在474nm处以1cm液池测其吸光度。3 结果与讨论3.1 吸收光谱按实验方法配制溶液后，于UV-3010型紫外-可见分光光度计上扫描吸收光谱（图2、图3）。图2表明，氯霉素在可见光区几乎无吸收（曲线1），茜素红在可见光区产生强烈吸收，最大吸收波长为530nm（曲线2，）当在茜素红溶液中加入氯霉素溶液时（pH 11.41），二者发生显色反应生成玫瑰红色络合物（曲线3），最大吸收波长为474nm，红移56nm。氯霉素在一定浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系（图3）。可见显色法可用于氯霉素含量的测定。图3 不同氯霉素浓度下，氯霉素-茜素红络合物的吸收光谱1. 氯霉素-茜素红（0.5mL）；2. 氯霉素-茜素红（1.0mL）；3. 氯霉素-茜素红（1.5mL）；13.试剂空白作参比；氯霉素：1.0×10-4mol/L；茜素红：1.0×10-3mol/L；缓冲液：pH 11.41图2 氯霉素、茜素红及其络合物的吸收光谱1.氯霉素，乙醇作参比；2.茜素红，乙醇作参比；3.氯霉素-茜素红，试剂空白作参比；氯霉素：1.0×10-4 mol/L；茜素红：1.0×10-3mol/L；缓冲液：pH 11.41 3.2 反应条件的选择3.2.1 稀释剂的影响 分别实验了水、乙醇作溶剂时对体系灵敏度的影响。结果表明，用乙醇作稀释剂时，体系具有较高的灵敏度，故本实验采用乙醇作稀释剂。3.2.2 显色剂用量的选择实验了不同量的茜素红溶液对体系灵敏度的影响。结果表明，浓度为1.0×10-3mol/L 茜素红溶液用量为1.62.3mL 时较为适宜。3.2.3缓冲溶液用量及pH值的选择考察了BR、Tris-HCl、NaAc-HAc等多种缓冲体系对氯霉素-茜素红体系灵敏度的影响，结果表明：pH 为10.6711.58 时用量为1.62.3mL的BR缓冲溶液显色效果较佳。本实验选用pH11.41的BR缓冲溶液，用量为 0.5 mL。不同pH对体系吸光度A的影响的曲线图(如图4所示)。3.2.4 时间对吸光度稳定性的影响按实验方法配制溶液后，在最大吸收波长处每隔一定时间测其吸光度，结果表明：开始时吸光度随放置的时间增加而增加，当放置15min时，吸光度趋于平稳，说明显色反应已达完全，其稳定时间可达2h 以上。实验选在15min 后测定。吸光度A对时间t的曲线图（图5）：图4 缓冲溶液用量及pH值的选择图5 时间对吸光度稳定性的影响 3.2.5 顺序对吸光度稳定性的影响实验了不同加入顺序的溶液对吸光度的影响，结果表明实验用的最佳顺序为：BR缓冲溶液+茜素红溶液+氯霉素溶液。 3.2.6 表面活性剂对吸光度的影响实验了几种表面活性对氯霉素-茜素红体系灵敏度的影响，结果表明：溴化四乙基钠、溴代十六烷基吡啶、SDS、十二烷基苯磺酸钠、溴化四乙基铵、OP、SLS、及溴代十六烷基三甲基钠等均无增敏作用。3.3 标准曲线和方法的精密度在10 mL 比色管中，按实验方法配制一系列不同浓度的氯霉素及茜素红体系，测其吸光度，作A-C工作曲线（图6）。本方法的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围及摩尔吸光系数等列于表1。表1 标准曲线相关系数测量方法 测量波长 回归方程 相关系数 线性范围 摩尔吸光系数 （nm） r （mg/L） （L·mol-1cm-1）显色法 474 A=0.09844+0.4094×105C 0.9975 0.310.8 1.11×104 图6标准曲线图3.4 络合物的组成本实验用摩尔比法和等摩尔连续变化法以最大吸收波长为测定波长，测得氯霉素茜素红=23，即（氯霉素）2（茜素红）3。3.4.1 摩尔比法在10支比色管里分别加入0.5mL BR缓冲溶液，再分别加入0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL茜素红溶液，最后分别加入1 mL氯霉素溶液，放置15min后，以水为参比，测定它们的吸光度(图7)。3.4.2 等摩尔连续变化法在11支比色管里分别加如0.5mL pH 为10.6711.58的BR缓冲溶液，再分别加入0.0 mL, 0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，3.5 mL，4.0 mL，4.5 mL，5.0 mL 茜素红溶液，最后分别加入5.0 mL，4.5 mL，4.0 mL，3.5 mL，3.0 mL，2.5 mL，2.0 mL，1.5 mL，1.0 mL，0.5 mL，0.0 mL 的氯霉素溶液，放置15min后，以试剂空白为参比测定它们的吸光度(图8)。图7摩尔比法F1=C茜素红/C氯霉素图8等摩尔比法F2= C茜素红/ C茜素红+氯霉素 3.5共存物质的影响用显色法试验了二十多种外来离子对1.0mL浓度为1.0×10-5mol/L的氯霉素溶液在相对误差±5%时体系吸光度的影响，结果列于表2。由此可见除少数物质对药物有干扰外，其它物质均无干扰。表2 共存物质的影响共存物质允许倍数共存物质允许倍数Pb(NO3)3CuCl2Na2SO4BaCl2 KNO3H2C2O4Na2CO3C12H22O11（蔗糖）Na2C2O4Zn(NO3)2SnCl2KClNaNO31.21.22106.12103.02202301153.01.5200200KOHCaCl2(NH4)2C2O4Bi(NO3)3Na2SO3C6H12O6（葡萄糖）柠檬酸钠Mg(NO3)2Hg(NO3)2NH4 NO3NaNO2Cu(NO3)2 Co(NO3)21106.13.01.51142321089.23.06.122.51.26.13.6 分析应用3.6.1 药物的测定取1支氯霉素注射液于1000mL容量瓶中，用无水乙醇稀至刻度。取该液3.2mL 用水稀至25.0mL、摇匀。取一支10mL比色管，向其中加入0.5mL BR缓冲液，再加入2.0mL 茜素红溶液，最后加入1.0mL 氯霉素样液，按实验方法定容至10mL，并在紫外-可见分光光度计上进行测定，平行测定6次，其测量结果如表3所示。表3 样品测定结果测得值/(mg/支) 测得平均值/(mg/支) 标示量/(mg/支) RSD/%246.9247.7246.1 247.0 250 0.5 245.4248.5247.73.6.2加标回收实验在一支10mL 比色管中，加入0.5mL BR缓冲液，再加入2.0mL茜素红溶液，最后加入1.0mL氯霉素样液和1.0mL氯霉素标准溶液，用无水乙醇定容至10mL，在紫外-可见分光光度计上测定吸光度，平行测定6次，其测量结果如表4所示。表4 加标回收实验： 取样药量 加入标准量 测得值 RSD/% 回收率/% 平均回收率/(ugmL-1) /( ugmL-1) /(ugmL-1) S/100% 3.16 3.23 6.37 99.4 3.16 3.23 6.35 98.8 3.16 3.23 6.36 1.05 99.1 99.0 3.16 3.23 6.36 99.1 3.16 3.23 6.34 98.5 3.16 3.23 6.35 98.8参考文献：1. 林海丹,秦燕,林峰,等.LC-MS-MS 测定水产品中氯霉素药物残留J.检验检疫科学,2005增刊:44-452. 沈美芳,吴光红,费志良,等.气相色谱法测定水产品中氯霉素残留前处理方法的比较J. 水产学报,2005,29(1):103-1083. 黄冬梅,于慧娟,李庆,等.GC-MS 测定水产品中氯霉素的残留量J.分析科学学报,2006,22(1):65-674. 欧阳立群,吴富忠,等.水产品中氯霉素残留量的高效液相色谱测定方法J.中国卫生检验杂志,2005,15(2):178-1805. 谢守新,林海丹,秦 燕,等.液相色谱-电喷雾串联质谱内标法测定水产品中氯霉素药物残留J.中国卫生检验杂志,2006,16(11):1298-13006. 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