2019-2020学年人教版生物选修3（课件）1.2 基因工程的基本操作程序 .ppt

目标导航,预习导引,1.简述基因工程的原理及基本操作程序。 2.能根据基因工程的操作程序设计出某一转基因生物的研制过程。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,一、目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。 基因文库包括两种:基因组文库,即包含一种生物所有基因的文库;部分基因文库,即只包含一种生物的一部分基因的文库,如cDNA文库。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,2.利用PCR技术扩增目的基因 (1)PCR的含义:一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 (2)目的:短时间内大量扩增目的基因。 (3)原理:DNA双链复制。 (4)过程 第一步,加热至9095 ,DNA解链为单链。 第二步,冷却至5560 ,引物与两条单链DNA相应互补序列结合。 第三步,加热至7075 ,热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。 如此重复循环多次。 (5)特点:指数形式扩增。,目标导航,预习导引,一,二,三,四,3.用化学方法人工合成 如果基因比较小,核苷酸序列又已知,也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,目标导航,一,二,预习导引,三,四,二、基因表达载体的构建 基因表达载体的组成:必须有启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。 1.启动子 启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录。 2.终止子 终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因尾端,使转录在需要的地方停止。 3.标记基因 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,目标导航,一,二,预习导引,三,四,三、将目的基因导入受体细胞 1.转化 目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。 2.常用的导入方法 (1)将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法。 (2)将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。,目标导航,一,二,预习导引,三,四,(3)将目的基因导入微生物细胞:Ca2+处理法。 用Ca2+处理细胞,使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。 将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。,目标导航,一,二,预习导引,三,四,四、目的基因的检测与鉴定 1.首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。 2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用分子杂交技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,从分子水平检测的方法是采用抗原抗体杂交技术。 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如需要做抗虫或抗病的接种实验等。,知识梳理,典例透析,一、获取目的基因的方法比较,知识梳理,典例透析,二、基因表达载体的构建 1.基因表达载体的组成及作用,知识梳理,典例透析,2.构建过程,特别提醒不同基因可以拼接的原因:不同生物的基因具有相同的结构和化学组成,都是双螺旋结构,都由四种脱氧核糖核苷酸组成;都遵循碱基互补配对原则,即AT、GC。,知识梳理,典例透析,3.几点说明 (1)基因表达载体载体:基因表达载体与载体相比增加了目的基因。 (2)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位,若目的基因插入到启动子内部,启动子将失去原功能。 (3)启动子起始密码子,终止子终止密码子:启动子和终止子位于DNA片段上,分别控制转录过程的启动和终止;起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译的启动和终止。 (4)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。,知识梳理,典例透析,三、目的基因的导入 1.不同受体细胞的常用导入方法,知识梳理,典例透析,2.农杆菌导入法分析,知识梳理,典例透析,(1)完成基因表达载体的构建,需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。 (2)重组的基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是用Ca2+处理法。 (3)目的基因能否在植株细胞内稳定维持和表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞的染色体DNA上。 (4)由棉株细胞形成抗虫棉需要运用植物组织培养技术。 特别提醒1.质粒和重组质粒是两个不同概念,插入目的基因的质粒称为重组质粒。 2.(1)农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物,因为在自然条件下,农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有感染能力。(2)单子叶植物常用的基因转化方法是基因枪法。,知识梳理,典例透析,四、目的基因的检测与鉴定,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,题型一 基因文库 【例1】 下列关于cDNA文库和基因组文库的说法,不正确的是( ) A.cDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程 B.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同,则这两个基因的结构也完全相同 C.cDNA文库中的基因都没有启动子 D.一种生物的cDNA文库可以有许多种,但基因组文库只有一种 解析:由于基因转录时只有编码区段才能转录,所以以mRNA反转录成的DNA就只有外显子区段,而缺少内含子和启动子等非编码区段,和原来的基因结构不相同。 答案:B,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,题型二 基因表达载体的构建 【例2】 如图是利用基因工程技术培育转基因植物,生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中Pst 、Sma 、EcoR、Apa为四种限制酶。下列说法错误的是( ),知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶Sma C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析:图示过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是标记基因,用于鉴别和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 答案:B,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,题型三 基因工程操作的具体步骤 【例3】 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后,分别含有 个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造,插入的Sma酶切位点越多,质粒的热稳定性越 。 (3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用Sma切割,原因是 。 (4)与只使用EcoR相比较,使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。 (5)为了获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入 酶。 (6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,解析:(1)切割前质粒为环状,不含游离的磷酸基团。切割后质粒成了一个链状的双链DNA分子,含两个游离的磷酸基团。(2)Sma识别序列中均为GC碱基对,G、C之间含三个氢键,热稳定性高。(3)据题图可知,Sma既会破坏标记基因,也会破坏目的基因。(4)若用同种限制酶切割质粒和外源DNA中的目的基因,因为两端的黏性末端能够互补配对,会出现自身环化的情况。而用两种限制酶切割,因为两端形成的黏性末端不能够互补配对,不会出现自身环化的情况。(5)DNA连接酶可以连接黏性末端互补的DNA片段。(6)标记基因可以用于鉴别受体细胞是否含有目的基因。,知识梳理,典例透析,题型一,题型二,题型三,答案:(1)0、2 (2)高 (3)Sma会破坏质粒的抗生素抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接 (6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞,