半薄超薄切片技术.ppt
半薄/超薄切片技术,背景：,半薄切片,超薄切片,？,一、超薄切片技术介绍,固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好,超薄切片的基本要求:,超薄切片主要步骤,取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染色,每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败,1 取材,1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般13，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(04)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。,1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。,2 固定 (抽气),2.1 固定的目的 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。,2.2 常用固定剂,(1)四氧化锇 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白； 固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原； 具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； 酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； 与乙醇/醛类反应生产沉淀漂洗 分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25； 固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难； 锇酸固定液常用浓度：12; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!,(2)戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； 渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等； 保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； 对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.51mm ,04可长时间固定(几周甚至12个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材; 缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。,(3)甲醛-Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好； 细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛； 缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失； 常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。,(4)高锰酸钾 强氧化剂，较好固定脂蛋白; 对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂； 只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.,3漂洗、脱水,3.1漂洗 漂洗的目的: 组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. 双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.,3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。,注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收缩。（ 30% 50%70%80%95%100%100%）; 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透； 脱水过程中应在70%脱水剂中4停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难; 置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。,4 渗透和包埋、聚合,4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。,4.2 包埋、聚合,包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。,包埋板,1,包埋管 胶囊,常用的包埋剂,环氧树脂(epoxy resin),水溶性树脂丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。 适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。,包埋操作中的注意事项 §所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； §所用器皿应烘干； §配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； §包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； §盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净. §皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；,5 超薄切片,5.1修块 削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。,5.2 超薄切片 超薄切片机：LEICA ULTRACUT R 超薄切片厚度: 100nm,一般 50-70nm,5.3 载网和支持膜,载网(超薄),直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm,5.3 载网和支持膜,(2) 载网支持膜 膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击. 支持膜的种类: 火棉胶膜 聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜) 碳膜,膜的厚度:10nm20nm,6 超薄切片的染色,目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度. 常用染色剂: 重金属盐 各种染料,常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。 染色方法： (1) 组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。,超薄切片染色,(2)超薄切片后染色,醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染,铀染:细胞核及结缔组织染色 铅染:提高细胞质成分的反差,1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积） 3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 3）后固定 1%锇酸固定 in 0.1M PBS，4°C overnight 4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%） 用丙酮置换乙醇： 乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次， 每级20-30分钟 6）渗透 丙酮:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/级 纯树脂12h， 换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！） 7）包埋聚合 60°C 24hr 注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2,超薄切片图片,二、半薄切片技术介绍,半薄切片主要步骤,取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 半薄切片 半薄切片染色,每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败,FAA固定液 （福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切片 一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩； 加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。,卡诺固定液,渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天,切片厚度：0.55um 切片捞到载玻片上,半薄切片,半薄切片染色,染料介绍,染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染,半薄切片：免疫荧光 （LRWhite包埋）,半薄切片图片,三、刀具介绍,玻璃刀,钻石刀,超薄切片机,型号：LEICA ULTRACUT R,谢谢！,
