乙肝表面抗原定量测定的方法学验证分析.pdf

乙肝表面抗原的ELISA 法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09级医学检验本科二班 指导老师沈 富 兵 二一三年四月 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者： ZP（成都医学院检验医学院09 级医学检验本科二班，610500） 【摘要】目的用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA 法定量分析试剂盒对乙肝表面 抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法运用 ELLISA 法定量测定乙 肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg 标准从浓度为8ng/ml 的 2 倍稀释的 6 个浓度梯度，根据OD 值绘制标准 曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果HBsAg 线性较好， 其准确度、 精密度、 LOD 值均在正常范内。结论ELISA 法定量检测HBsAg 能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复 制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】乙肝表面抗原方法学验证标准曲线精密度ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区， 普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus ，HBV) 感染率接近 60，约占世界 HBV 携带者的 1/3 。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝 硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊 断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV EIA是HBV 抗原和抗体最 常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附 技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用 聚苯乙烯为固相载体， 使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记 的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。 此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml ，且酶免疫法有标记的试剂 比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分 析来验证 ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原 ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统： Millipore Elix ； 电热恒温培养箱 (DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 0.01M pH7.4 的 PBS 缓冲液： 称取 8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4, 溶于 800ml 蒸 馏水中，用 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可。 质控品： 用 PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml 三个质控品，每质控品1ml。 首先取 450 l 的 8ng/ml 的标准品到 C1 号 EP 管中再向其中加入150 l 的 PBS缓 冲液，即配制成了6ng/ml 的质控品，再取300 l C1 号 EP 管内的溶液到 C2 号 EP 管内，再向 C2 号管内加入 300 l 的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml 的质控 品。接着取 300 l C2 号管内的液体到 C3 号 EP 管内，再加入 300 l 的缓冲液混 匀，即配制成了 1.5ng/ml 的质控品。具体方法如下图1 图 1 1.2 检测方法 1.2.1 标准曲线各浓度的配制 用 PBS 缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。 先取 6 个 EP 管分别标记为对应的浓度。 取 400 l 标准品于标记为的 EP管中，再取 200 l号管内液体于号管 内再向号管中加入 200 l 的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml 的标准品。 再从号管内取 200 l 的液体到号管内，接着取200 l 的缓冲液到号 管内混匀，即配制成了2ng/ml 的标准品。 从号管内取 200 l 的标准品到号管内，再向号管内加入200 l 的缓 冲液混匀，即配制成了1ng/ml 的标准品。 用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml.的标准品体积分 别为 200 l、200 l、400 l 备用。具体方法如下图2 图 2 1.2.2 测定方法 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系 列标准品、质控品及空白对照； C3 1.5ng/ml C2 3ng/ml C1 6ng/ml S6 0.25ng /ml S5 0.5ng/ ml S4 1ng/ml S3 2ng/ml S2 4ng/ml S1 8ng/ml 图 3 注：双线框区域为标准品,浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三线框区域为质控品，浓度依次为6、 3、1.5ng/ml，粗框区域为空白对照加入的是PBS 缓冲液，每个孔内加入的均是50 l。 37温育 30min，洗板 4 次； 加入酶标抗体，生物素二抗，50 l/孔； 37温育 30min，洗板 4 次； 加入 A、B 液，50 l/孔，37温育 15 分钟； 加入终止液， 50 l/孔。 1.3 标准曲线制作及结果计算 酶标板放入酶标仪，盖上盖子； 在电脑上打开 Microplate Manager 5.2软件； 选择 450nm 波长（参照波长 630nm） ，设置 LAYOUT 和报告模式，测定 各孔吸收值； 输入标准品各浓度值， 以双对数法制备标准曲线， 获取各孔的浓度值， 打 印标准曲线图和计算结果。 1.4 统计学方法 用 Microsoft Excel 处理实验数据。 2 结果 2.1 测得的 OD 值如下表 8 8 6 3 1.5 - 4 4 6 3 1.5 - 2 2 6 3 1.5 - 1 1 6 3 1.5 - 0.5 0.5 6 3 1.5 - 0.25 0.25 - - - - - - - - - 图 4 注：图 4 与图 3 相对应 2.2 标准曲线 图 5 由上图可得出如下结论： 标准曲线以浓度为横坐标， 以测得的 OD 值为纵坐标。 由对应浓度和 OD 值 得出的散点连成一条直线后， 散点基本都在直线上， 说明散点的线性非常好。 在 以后检测乙肝表面抗原浓度的时候可以根据测出的OD 值在标准曲线上找出对 应的浓度。 2.3 准确度（回收率）计算 各质控品高中低三个浓度平均回收率分别为92.59%、100.887%、93.68% 都在正常范围内如表 1 所示。 1.7390 1.6380 1.0850 0.6920 0.3380 0.0150 0.8840 0.8880 1.2170 0.6740 0.3530 0.0090 0.5360 0.5090 1.2180 0.6560 0.3380 0.0100 0.2720 0.2600 1.2330 0.6740 0.3470 0.0090 0.1490 0.1380 1.2480 0.6960 0.3430 0.0120 0.0620 0.0710 0.0090 0.0120 0.0020 0.0090 0.0090 0.0110 0.0090 0.0110 0.0100 ELISA 法检测 VEGFR2-Fc的回收率 准确度（回收 率）计算 VEGFR2-Fc (ng/ml) 测定值 (ng/ml) 回收率 (%) 平均回收率 RR(%) SD(%) 6 4.998 83.3 92.59 5.30 6 5.637 93.95 6 5.642 94.033 6 5.715 95.25 6 5.787 96.45 3 3.093 103.1 100.887 2.60 3 3.005 100.167 3 2.918 97.267 3 3.005 100.167 3 3.112 103.733 1.5 1.377 91.8 93.68 2.07 1.5 1.450 96.667 1.5 1.377 91.8 1.5 1.421 94.733 1.5 1.401 93.4 表 1 2.4 精密度计算 2.4.1 板内精密度 板内精密度质控品各浓度组的RSD 都小于 15%，精密度良好， 如表 2 所示。 板内精密度 VEGFR2-Fc （ng/ml ） 测定值 1 测定值 2 测定值 3 测定值 4 测定值 5 RSD(%) 64.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694 ±0.318 5.585 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.0782.577 1.51.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.031 2.210 表 2 2.4.2 板间精密度 板间各组浓度质控品RSD 都小于 15%，说明板间精密度达到标准。如表3 所示。 XS 板间精密度 VEGFR2-Fc （ng/ml） 测定值测定值测定值测定值测定值 RSD(%) 6 4.998 5.637 5.642 5.715 5.787 5.694 ±0.318 5.585 6 5.471 5.423 5.674 5.323 5.746 5.5274±0.177 3.202 6 5.773 5.674 5.782 5.547 5.667 5.689±0.096 1.687 3 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 3.027±0.078 2.577 3 2.815 3.335 3.187 3.221 2.933 3.098±0.216 6.972 3 2.886 3.344 3.118 3.234 2.997 3.116±0.182 5.841 1.5 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 1.405±0.031 2.210 1.5 1.226 1.257 1.227 1.564 1.334 1.322±0.142 10.741 1.5 1.665 1.243 1.236 1.541 1.320 1.401±0.192 13.704 表 3 2.5 检测限（ LOD）计算： 取空白孔的 OD 值的均数加 2 倍标准差。 空白孔的 OD 值的均数 =0.0098 空白孔的 OD 值的标准差 =0.0028 LOD=0.0098+2*0.0028=0.0154 3 讨论 通过图 4、图 5 和表 1、表 2、表 3 可知本次实验的准确度、板内精密度、板 间精密度、 LOD 值都复合实际，且各数据都趋于理想，对此我们做出分析： HBsAg是乙肝病毒感染后最早出现的血清标志物之一，因此 HBsAg的检测是 诊断肝炎病毒感染的重要依据。 而针对这项检测的检测方法的灵敏度与高特异性 的高低以及二者的结合程度是影响检验结果的重要因素，直接关系到临床诊断和 用药，所以对 HBsAg的检测方法的建立和方法的验证是实验成败的关键所在。 本实验以 HBsAg 测定为例，为了对乙肝表面抗原ELISA 法定量进行分析的 方法学建立与验证，以确认ELISA 法定量检测 HBsAg 能否较准确、快速地反映 体内乙肝病毒复制情况。 按试剂说明书严格操作的同时做标准曲线。本实验用的 试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA） 。往预先包被人乙肝病毒 表面抗原（ HBsAg）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标 记的检测抗体， 经过温浴并彻底洗涤。 用底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的 催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 XS 人乙肝病毒表面抗原（ HBsAg）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光 度（OD 值） ，计算样品浓度。本实验严格按试剂说明书操作的同时运用计算机 软件和酶标仪，测得了OD 值且绘制出了标准曲线。 本实验采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA） ， 通过倍比稀释来完成 其定量检测。其中，标准品的浓度依次为：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每个 浓度设置两个孔，共十二个孔；质控品的浓度依次为:6、3、1.5ng/ml，每个浓度 设置五个孔，共十五个孔。往标准品、质控品依次加入标本、标准品、HRP 标 记的检测抗体， 而阴性对照加入等量PBS,经过温浴并彻底洗涤。 用底物 TMB 显 色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄 色。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（ OD 值） ，计算质控品的准确度、板 内精密度、板间精密度、LOD 值。 本实验是设计精密，操作简便、快捷。主要是通过对质控品的准确度、板内 精密度、板间精密度、 LOD 值的计算和根据标准品的OD 值得出的标准曲线， 以确认 ELISA 法定量检测 HBsAg 能否较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情 况。 如图 5 所示，标准曲线相关系数为0.9985，接近于 1，即相关性良好。方法 准确度 (accuracy)，一般用相对回收率表示，表明用该方法测得的生物样品中待 测药物的浓度与其真实浓度的接近程度，由表1 可得出相对回收率符合参考值 85%115%，所以该测定方法比较准确。 方法精密度 (precision)，一般用 RSD 表示，对于 ngml 级水平的 RSD 一般 应15 。由表 2 板内精密度和表 3 板间精密度可知， 板内精密度完全符合要求， 板间精密度基本符合要求。 检测限 LOD，又称方法的灵敏度，由计算得LOD=0.0154，说明本分析方法 对于低浓度样品的检测灵敏度高。 根据流行病学调查 , 我国人群乙型病毒肝炎感染率达10% 左右,乙肝的实验 诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。ELLISA 适用于乙肝表面抗原的定量测 定, 其优点是快速、方便、操作简单, 且灵敏度相对于其他方法较高, 自 20 世纪 70 年代以来 , 许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测, 特别是酶联免 疫法( ELLISA 法)应用最广，其解决了低浓度HBsAg 的定量检测问题 , 能够及时 有效的测定出乙肝表面抗原含量，对临床诊断和用药提供有力的依据。 综上所述，通过实验对HBsAg 的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD 值的评价和分析， 证实该定量检测方法， 具有高灵敏度和高特异性， 能够满足临 床检测和教学的要求。 参考文献 1 李金明，王露楠，徐锡霞，等室内质量控制对乙型肝炎表面抗原准确的影响J中华 检验医学杂志，2001，24(4) ：255 2 施纪文，徐简华，温惠萍ELISA 法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原的比较J. 现代检验医学杂志，2005，20（5）： 49 3 章敏，万唐，彭慧中，等前S2、前 S1抗原与乙肝病毒标志物的相关性探讨J实验与 检验医学， 2009， 27(6)：609 4 陈慧英，张锦锋，岑小鹏，等.ELISA 检测乙型肝炎HBsAg 室内质控血清的试剂和使 用J.上海医学检验杂志，2000，15（4） ：203-205 5 周小辉 ,周元平 ,姚春平血清HBV DNA 复制与慢性乙型炎肝脏损伤程度的研究J中 国现代医学杂志,2000,13(4)：133-135 6 梅小平 ,李健 ,曾跃乙型肝炎病毒DNA 水平与临床的关性分析J中华肝脏病杂志, 2004,16(5)： 19-21 7 赵公之乙型肝炎病毒DNA 检测与临床J中国实用医药,2006,9(4)：87-88