乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证毕业.pdf

毕 业 论 文 题目：乙肝表面抗原的ELISA 法定量分析方法学验证 姓名： 学号： 专业： 指导教师： 教师职称： 研究起止日期： 研究提交日期： 二 一三 年十一月 目 录 毕业论文乙肝表面抗原的ELISA 法定量分析方法学验证 中文摘要 1 英文摘要 1 前言2 1.材料与方法 .3 1.1 试剂盒 3 1.2 仪器.3 1.3方法.3 1.3.1 溶液配制 .4 1.3.2 铺板方案 .4 1.3.3 加样步骤 .5 2. 结果6 2.1 标准曲线与线性范 6 2.2 准确度（回收率）的验证6 2.3 精密度的验证 7 2.3.1 板内精密度的验证 .7 2.3.2 板间精密度的验证 .8 2.4 检测限（ LOD）计算 .10 3. 讨论.10 3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义.10 3.2 常用定量分析方法 .11 3.3 方法概述 11 3.4 方法学验证内容 12 3.5 结果分析及应用评价 .13 参考文献 14 综述15 致谢18 乙肝表面抗原的ELISA 法定量分析方法学验证 中文摘要 目的 ：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg 的 ELISA 法定量 分析试剂盒进行方法学验证， 以判断是否能用于临床样本分析。方法： ELISA 法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml 做 2 倍稀释的 6 个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯 度 5 复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线 R2=0.997， 准确度 97.07%，1.5ng/ml 的 RSD 为 16.78%，不满足 ng/ml 级水平的 RSD 一般应 LOD，此标准曲线上最 低浓度点为 0.25，大于LOD（0.172） ，故此标准曲线线性好。 3. 讨论 3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对 乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临 床医学的发展， 乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的 要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上 有明显的不足。随着检验医学的发展， 乙肝两对半定量测定成为可行， 大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可 与HBV DNA 荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效， 为低含量的慢性乙肝、 病毒携带者提供了正确判断病情的依据。这在 目前的临床治疗中应用十分广泛。 3.2 常用定量分析方法 此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证，而目前 常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA 法又称解离增强镧系荧 光免疫分析， 是近十年发展起来的一种微量分析方法。此技术集酶标 记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定 性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等 特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法【3】 。全自动酶免分析 仪目前也广泛应有， 自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程 控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【4】 ，使检测结 果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。 3.3 方法概述 目前普遍使用的 HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单 克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避 免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【 5】 。本次 实验是对实验室的一种试剂盒， 即福州蓝图生物工程有限公司生产的 HBsAg的ELISA 法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用 于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。 往预先包被 HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品， HRP标记的检测抗体， 经过温育并彻底洗涤。 用底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。 颜色的深浅和样品中得 HBsaAg呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下 测定吸光度 OD值，计算样品浓度。 应用试剂盒 HBsAg标准品从浓度为 8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6 个浓度梯度做标准曲线， 以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度 5复孔做质控， 进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为 0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数 HBV 感染者外周血中可出现 HBsAg，含量在 5ng/ml 600ug/ml之间，高者可达 2000ugml以上 【6】 ，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。 3.4 方法学验证内容 方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。 标准曲线亦称校正曲线， 系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的 相关性，通常用回归分析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了 6个浓度点建立标准曲线。方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近 值了，一般用相对回收率表示， 限度要求在 85%115%的范围内。精 密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致 性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于 ug/ml级水平的相对标准偏差一般应10%, ng/ml级水平的相对标准偏 差一般应 15%。检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为 灵敏度。 3.5 结果分析及应用评价 第一组数据标准曲线 R2=0.9973， 显示具有良好的相关性， HBsAg 浓度为 6ng/ml和3ng/ml 的回收率分别为为 97.58%，符合113.07%，符 合限度要求在 85%115%的范围内。但是 HBsAg 浓度为 .5ng/ml的回 收率为 80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。在精 密度方面，6， 3， 1.5ng/ml变异系数 CV分别为 12.73% ， 3.69% ， 3.50%， 而HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数 CV值为12.73%， 显示孔间差异 较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应 15%的要 求，其中有一孔浓度为 4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操 作引起例如加样不准不属于试剂盒的问题，故可以认为此试剂盒对于 批内高、低浓度样品的检测精密度还是可以的。在做3个组数据的批 间的精密度分析时，发现6，3，1.5ng/ml变异系数 CV分别9.10%， 12.06%，16.78%，分布方式从低到高，前 2个浓度满足对 ng/ml级水平 的RSD一般应15%的要求。 1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足 ng/ml 级水平的 RSD一般应 15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精 密度不是很高。 综上分析，该试剂盒对于高浓度样品的检测具有良好的准确性 和较高的精密度， 而对于低浓度样品 （1.5ng/ml）的检测在准确性和 精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。 目前绝大 多数HBV 感染者外周血 HBsAg浓度很低，该试剂盒不能全面检测出此 类人群，故该试剂盒不能用于临床标本的检测。 参考文献 【1】魏来，陶其敏努力规范肝脏疾病的免疫学诊断中华检验杂志，2003， 26：6971 【2】刘晓梅，张世兰 HBsAg 阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床 的关系 J 】临床检验杂志， 2004，22(5) ：381-382 【3】李辉霞，王德志，杨朋，乙肝两对半定量检测及临床意义，医学信息杂志 2010，23（9）。 【4】 Weber B, Dengler T, Berger A . Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surface HBsAg detection IMMUIITE HB sAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg J J .Clin Microbiol , 2003 , 41,(1 )；13 5143 【5】郑怀竞临床免疫学检验质量保证M 北京：北京医科大 学，中国协和医科大学联合出版社，1995，99 【6】 王朝阳，段文强 , 乙肝两对半阴阳性之临床意义， 中国社区医师杂志， 2007， 26(1) ：12-13. 综述 乙肝表面抗原是人类在感染乙型肝炎病毒后出现的第一个病毒血 清学标志物 ,通常在临床症状出现之前即在血液中出现。我国是乙型 肝炎病毒的高发区 ,加强对乙型肝炎 (简称乙肝 )的检出能力 ,是保障我 国人民健康 ,促进经济发展和社会进步的重要措施。由于病毒感染的 窗口期问题、乙肝试剂检测质量以及实验中的各种不确定因素影响着 医院对乙肝病毒的检测。随着医疗检验技术的发展,临床检测乙肝表 面抗原采用的方法有了新的发展,尤其是发光法定量 (或半定量 )检测 乙肝表面抗原近年有上升趋势。结合我国乙肝病毒感染的现状,选择 反应快、灵敏度和特异度均高但又要成本低的检测方法至关重要。我 们在追求低成本检测的同时,必须保证检测的质量。乙肝表面抗原是 乙肝两对半的其中一项， 乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病 情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝 两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效 观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着 检验医学的发展， 乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两 对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA 荧 光测定相互补充， 综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙 肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据。这在目前的临床治疗中 应用十分广泛。此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验 证，而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA ，TRFIA 法又称解 离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。 此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、 特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简 便和非放射性等特点， 成为最有潜力的一种标记免疫分析方法。全自 动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达 到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度， 使 检测结果更趋稳定， 从而保证了实验结果的可靠性。目前普遍使用的 HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被 抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避免竞争抑制，最大程度 地解决钩状效应（ HOOK）的问题。本次实验是对实验室的一种试剂 盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA 法定量分析 试剂盒进行方法学验证， 以判断是否能用于临床样本分析。试剂盒采 用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被 HBsAg捕获抗体 的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过 温育并彻底洗涤。用底物TMB显色， TMB在过氧化物的催化下转化 为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中得 HBsaAg呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度 OD值，计算 样品浓度。应用试剂盒 HBsAg标准品从浓度为 8，4，2，1, 0.5 ， 0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度 5 复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低 浓度为 0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV 感染者外周血中可出 现HBsAg，含量在 5ng/ml 600ug/ml之间，高者可达 2000ugml以 上，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。本研究旨在了解目前临床 乙肝表面抗原检测方法的变化,并对新应用的发光法检测系统的性能 作出评价 ,对检测质量的提高和优秀的检测系统在临床的推广应用非 常重要。本次研究的目的是对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的方法学性 能和实验方法进行评价和分析。 研究方法是取卫生部临床检验中心指 定生产的 HBsAg的弱阳性质控血清 ,进行项目给定的临界值浓度 +20%、-20%的配制,并对其检测 ,建立自己实验室的临界值浓度范围; 连续20d对HBsAg的弱阳性质控血清进行检测,计算s/co值,统计分析日 间精密度 CV;用EQA的质控物检测 HBsAg,进行阴阳性符合率计算。 研 究结果是 HBsAg定性试验的临界值分别为0.55U/ml;阴阳性符合率全 部为100%;HBsAg:日间精密度 CV11.42%。结论 HBsAg定性试验的 分析性能能满足临床要求,评价方案简单易行 ,项目临界值水平与厂家 提供的不完全相同 ,说明厂家提供的方法学指标不能直接引用,各临床 实验室应建立自己的分析性能指标。 致谢 在本次论文设计过程中，感谢我的学校，给了我学习的机会， 在学习中，老师从选题指导、论文框架到细节修改，都给予了细致的 指导，提出了很多宝贵的意见与建议， 老师以其严谨求实的治学态度、 高度的敬业精神、 兢兢业业、 孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取 精神对我产生重要影响。 他渊博的知识、 开阔的视野和敏锐的思维给 了我深深的启迪。 这篇论文是在老师的精心指导和大力支持下才完成 的。他们严谨的学术态度， 幽默风趣的授课方式给我留下了深刻的影 响。在这篇论文构思和写作过程，我的论文指导老师王敏教授，对我 论文的完成更是功不可没， 张老师每次对我的疑问给予细心的解答并 给出写作建议， 对我的论文进行细心的修改， 使得我的论文结构一步 一步的完善，内容日趋丰满。没有张老师的细心指导，这篇论文是不 可能完成的。 感谢所有授我以业的老师， 没有这些年知识的积淀， 我没有这么 大的动力和信心完成这篇论文。感恩之余， 诚恳地请各位老师对我的 论文多加批评指正，使我及时完善论文的不足之处。 谨以此致谢最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位 老师表示衷心的感谢。