吸收光检测原理及应用.doc

吸收光检测原理及应用1.检测原理a)布格-朗伯-比尔定律，是光吸收的基本定律，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。b)朗伯-比尔定律： OD = C b 光吸收值（OD）与浓度成正比c)比尔朗伯定律数学表达式: A=lg(1/T)=KbcA为吸光度,T为透射比,是透射光强度比上入射光强度 K为摩尔吸收系数.它与吸收物质的性质及入射光的波长有关. c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度d)物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比。2.吸收光的应用a)生物大分子定量：基于260nm、280吸收光检测-核酸定量i. 核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的性质。最佳测量值的范围为 0.1 至 1.0。每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如： 1OD 的吸光值分别相当于 50g / mL 的dsDNA， 37g / mL 的 ssDNA， 40g/mL 的 RNA， 30g/mL 的寡核苷酸。ii. A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。iii. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为2.5。若比值小于 2.0 表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。iv.A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度，该值应该接近 0.0。假如不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。v.核酸的吸光值受 pH 值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的 pH 值和低离子浓度的条件下（如 10 mM Tris-HCl pH8.0），才能得到精确的检测结果。b)生物大分子定量：基于260nm、280吸收光检测-蛋白定量i. 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.11.0mg/mL。ii. 由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收值也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.33.0之间，平均值为1.250.51。所以此种方法测量的准确度差一点。iii. 若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。iv. 常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260 ； (A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)v. 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d；其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子c)酶联免疫吸附实验-ELISA-疾病因子，动物疫病，食品安全i. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ii. 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。iii. 如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。d)细菌、细胞生长密度及生长曲线绘制：基于OD600吸光值i. 单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即调整期（延滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定期）、死亡期（衰亡期）。 ii. 生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 iii. 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。e)细胞的毒性及增值：MTT、XTT、CCK8i. 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢（Z）（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臢（Z），用酶标仪在490nm波长处(英文说明书写的是570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。ii. XTT作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。iii. Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。f)报告基因：-半乳糖苷酶、GUS等i. 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。ii. 半乳糖苷酶：半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻硝基苯D半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红D半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷（FDG）为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学（FACS）分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。iii. gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码-葡萄糖苷酸酶。-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。g)酶活性检测：一段时间内，在特定温度条件下进行的动态监测。各种吸收光光谱范围内都有所涉及。h)吸收光光谱图绘制在我们检测时,利用不同波长的单色光作入射光,按波长由短到长的顺序依次通过某一溶液可测得不同波长的吸光度A.然后以入射光的波长为横坐标,吸光度A为纵坐标作图.所得曲线即为该溶液的吸收光谱（absorption spectrum）,又称吸收曲线（absorption curve）。