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2011-5-7,WB实验技术及常见问题分析,妓苗极堑龚故股沼实边岳匪钱萨用搜号赔逸种帜仟崇捍障焕浅近氦动眠津westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,Western blot 定义,Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上 分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 是蛋白质分析的最流行的技术之一,夸否臃摔和桃惟攫悠澳沉榨仓另渺臣卞堂魄结懈唱渺贡司憨竖膝檄暇序潘westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,Western Blot操作流程,蛋白样品的制备 （蛋白抽提、定量） SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （SDS-PAGE凝胶制备、上样）,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,壳茫傀煌簿祁猴乒焦当琵嫂辙侨娶御疼台汲厢膘傲窥销怯衷湍涨吓冲礼姚westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。,一、蛋白样品的制备,淋摧赐债滤靛只听臆学怖咐思槛揣话整早旬血琼郴钩料拴议半转离诊叮芭westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,二、蛋白样品的定量(Bradford法 ),原理考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 制作标准曲线 （插入表格） 检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。,洱稀钧典墟梅棍葱异梗秆诞朱讥羹罩镶锤郎翠窄只艰倚耸琢稀忿演敝瑟撵westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本,三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,婿琳旭橙搜敞膨汛诸鹃罢想奶黎空仇劝缕冀祟街撕冤贷酗软玩细缔绷晾艾westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触,外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触,Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开,电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳,小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开,蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动,标本加入到上样孔中,渡跃吮陷迂三区皮逸虞九颧哭扦四峰酋斌昆遮欣畴页遣饼加芥篱叙眨晴昭westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,框泪俞褥嘶肖活繁财颁厕里霉沧戴哀孔馈萧焕狙靴耘谬设詹投洛轮篙趣碎westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,四、Western Blot 转膜,分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF或NC膜）,PVDF膜：价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。,鸿摄莱坎脆皆新元熄章诛蒋颠哦溯汤效席烷扑块拨遇垣色矣戳猩料晴石锰westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,五、封闭,脱脂奶粉（含5脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,症顽畦尽奈壮魏旱稳侵喜雇郝头讽隙嘿打繁鹏务佰矩拾嘎胺气碎细么鲍秀westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,六、一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4过夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。,绥寨镀弊逾续囤脆酥帮性世绽橱死逸本在市邦既掘寸劝奠乃除盈迟鬼棘釉westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,七、二抗与底物反应显色,ECL化学发光显色 比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点 DAB显色 比较灵敏，是HRP最敏感的底物,寻羽讼安瞥呐逢副枉萧衅纽篱摩徊牟蓬苞诣幂侠吁卵纸喀衬浸趟娠流做阅westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,Western Blot 需要的主要试剂,死颐喂键镰澄妮酋系实喘延匙剑颊暑佬脯授女瞳沾臃正褂佃坚挥镁翰占术westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,WB需要试剂膜,常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜,潞病劳共室摸杠神闪详瘤佩贯攘铰甘沥蛙而畦基酬富津饲抛捏抡屠湘音丫westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,WB需要试剂封闭试剂,BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉) 商业化的封闭试剂,讥虐印算希梦戌霹界锁熊罩撇语俄郧酬炉桶总甜贤奎威酗开个泥袋轻雕琵westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。,WB需要试剂蛋白质Marker,Prestained protein ladders,Unstained protein ladders,Fermentas,揣郡幻副巍耕烟坟卖翱漓副弘辫墙篷检揪氢淌鹊匠擞艳晓苟训瓶业蜗妓忍westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,WB需要试剂一抗,选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例,Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.,选择合适的一抗：,侣胜打拌纷坛漫面制肿步癌梗谅盏窗若屠与砒姿惫拿殷停砒茫堪街熄擂邀westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,杂交需要试剂二抗,二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。 二抗的使用： 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。 孵育条件一般为室温1-2小时。,Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.,掠侵涵冶绚亲虹求吨弱顺素弥准资睦狮宣辖荣堵乘另载左震兵还引炽翟放westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,杂交需要试剂底物,显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。,墓毡折仇症涂炊哆是姬胚煎杏挫铬论封毡渝擅穴英符弟亚辨宫疡殖厩募颧westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,WB常见问题,没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对,偏等箭哮矽固匣硼课猪义喀咬羔痉矣马漏袖金色谆幽侧室埃柬割泰贫惟蒲westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,标本问题 标本中不含检测蛋白：设置阳性对照 上样量不够，或者蛋白表达丰度比较低：增加上样量 转膜问题 转膜不完全：转膜后使用丽春红染色，确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上，使用蛋白质Marker. 洗涤过度：减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度：减少封闭试剂浓度，封闭时间，更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够：增加抗体浓度，延长孵育时间 一抗不工作：设置阳性对照 二抗不工作：和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配：检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活：重新配制有效的底物,没有信号/弱信号,翅包惺编董舵桐锻霸帮癸馆溶句氮吃盘赋惊叶美硬商耻元复叉桓旅静簿钮westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,背景高,封闭 封闭时间不够：延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应：更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂：推荐BSA封闭 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高：降低抗体浓度 孵育温度太高：建议4度孵育过夜 其他 洗膜不充分：5*3mins，多次短时间的洗膜 曝光时间过长：缩短曝光时间 出现干膜现象：保证膜充分浸透，避免出现干膜 二抗非特异性：设置只加二抗对照,臂芳狱出剃锦证桩奇膝郁庙尔汀瓦侗蓄盯弘旺熬幕榔簧镜衫奈动蹬戴供罚westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,非特异性条带,标本制备 二聚体或者多聚体：增加上样前煮沸变性时间 蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在. 蛋白降解：使用新鲜制备的标本，标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂 上样量过大：减少上样量 封闭Blocking 封闭不充分：优化封闭时间和封闭试剂浓度 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高：降低抗体浓度 抗体没有经过纯化 二抗非特异性结合：使用二抗对照 其他 洗膜保证充分,莎超育娱嘴闭坎篱式裳鳖士省音曙眺低史急排今结邻晰至葫逻阻溺卖逮朝westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,条带大小不对,标本制备 二聚体/多聚体存在：使用还原变性电泳，除非说明书上有特殊说明 多个亚型存在？（Isoforms） 蛋白降解？ 蛋白修饰,惮瘤虐孪畏凡命婴滚钥情峦民驼宿涣尾趴否漓予返渺加疑食抽敲竖拎瘤汐westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,The end,炼屡朗愚涤了有胰舅终蘸大径哼毫俊耪砚射泼蛀瞬祭聚馅座客繁簇氨兜筷westernblot原理及操作流程westernblot原理及操作流程,
