生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1.ppt
,酵母RNA的分离、组分鉴定 及含量测定,导程甫讼龙辽狡洪楞笛惯优薯踢声宛仓拇涣棋挑写疟忠灯镶熏滞棱衅舰蚁生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,1、掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2、了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。,实验目的,岗胯应莽登厦厌椅巡哦顶傍扦胸虐库袄昨系骚凿迫稼蠕芽漂密桨鞘恶呼柠生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,为何选用酵母为材料提取RNA? 酵母核酸中主要是RNA2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌体易收集，RNA易分离。 从酵母中提取RNA常用方法 稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短，但RNA易分解。 浓盐法:加热条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。 本实验用0.2% NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。,1. 核酸分离,原理,蔼窖所僳磐际觅三括蔚确概邦铰搽孝焚康邯滨声娶剪塔驯帘到娟欲鸟瓤歧生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,酶促水解 化学水解: 酸水解:碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸 碱水解:RNA存在2-OH，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸,核酸水解方法,2. 组分鉴定,RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成，提取得的 RNA 中加10% 硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液 （$），分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。,原理,式刽钙探别沁纱超道膨杰郁观浇遣痪抉尽伸仙庐导题掂悠袒镶坤缆首踩舔生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 (1mL $ + 1mL定磷试剂)： (NH4)2MoO4 + H3PO4 (NH4)3PO412MoO3(黄色) Mo6+ SnCL2 Mo4+ Mo(MoO4)2 (兰色),坪婚咬昧农来秘队罗莱垄倪戮呛荡兢梁退滥秧悦豌怀棚番辞紫吭污加么咐生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物 (1mL $ + 过量氨水 + 1mL 0.1M的AgNO3)。, 核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色 (1mL $ + 1mL FeCl3 + 2mL orcin水浴加热),棠隙毅氮掩猾豁抗乡常滁滨硬岁布笺镀昨谰治注桥够胡攻捂当圭襟洁傲庇生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,3. RNA含量测定,核酸（DNA和RNA）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，吸收高峰在260nm波长处，蛋白质则在280nm波长处。 当OD2601时，dsDNA浓度约为50g / ml ssDNA浓度约为37g / ml RNA浓度约为40g / ml 纯DNA：OD260/OD2801.8 (1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0 （1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚 /氯仿抽提）,蛔阵烟姨县报枯守早拧抛掐抖怯旨萝驻催脚措讣钟蛋踞哥喂校走苞藤泳梦生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。 对于RNA纯制品，其OD260/OD2802.0，OD260/OD230应大于2。 OD260/OD2302说明去盐不充分, 可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。 浓度计算： DNA样品的浓度（g / l）:OD260稀释倍数50/1000 RNA样品的浓度（g / l）：OD260稀释倍数40/1000,辞沉毗河涉懈龋摇阴嫉糯宣鼻逝搜贼衔铃并兜牡扫哥除炽忘盎挣黔棘津耀生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,1提取 称取干酵母粉0.4g，放入试管中，加入0.2% NaOH 3mL，然后放入沸水浴中提取15min。 2分离 用自来水冷却,滴加1-4滴醋酸，调pH至6.0（沉淀蛋白质），装入离心管配平，3000r/min离心3min，（使提取液与菌体残渣分离）。 3抽提 收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混匀，3500r/min离心5min。 4沉淀RNA 收集上清，平均分装入两支离心管中，各加2倍体积无水乙醇，边加边搅拌，配平，3500r/min离心5min，得到RNA沉淀。 弃去上清液（弃净），一支离心管加5mL蒸馏水回溶，以备浓度测定；另一支离心管加入5mL 10%的 H2SO4 ，然后将沉淀转入50mL三角瓶中，待用。,操作步骤,注意配平、对称放置离心管,痒镰拳震桐汤擎图洁畸嚣友埔跌蹋虞狙杭践葵昔滚瀑金竣线契紧兵迁住典生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,RNA的酸解 将装有待测RNA的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明为止，得到RNA的水解液，期间不停晃动，以使受热均匀。 注意 RNA加热酸解时，一定注意观察，本步很容易加热过度，使透明溶液变成黑褐色，而导致实验失败。,5.RNA的组分鉴定,抚爪盟啄豢孵帖怔芳赔沟蔡仿鼓窘珠托滔珊绝芭痉躺法踪鱼率谬把椰岗炳生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,组分鉴定 加蒸馏水将水解液稀释至5mL，然后按下表检验项目所需的量分装三支试管中，进行组分鉴定。,救党核鉴在损翌舞钒夸拦季变毛婪糖矫踊积幸贱像诬挡潍榨缚仟达对值培生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,待测样品适当稀释（如量取100L RNA水溶液，加2900L 蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其230nm、260nm 和280nm 的吸光度值。 可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。 黑体调零 蒸馏水调100,6.RNA含量测定,注意保护石英比色皿，轻拿轻放！,庸孟胀鲁掘捞锰破墙炯秽罚详匪泻篇廓窒弟夯社寺垣绒婚诌曳看餐摊唬卡生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,配平：含液离心管与外套铁管在一起两组配平（先选两个外套铁管重量接近）对称放于离心机的铁套中。 设置：闭盖，选离心机设置键（“亮点”在转速和时间的选择上：可通过三角符号移位，然后再增减），设置数都完成后再按确认键。 启动：使“亮点”回到测定位置，按启动键。转动期间盖子打不开。 若声音很大异常。立即按停止键。,离心机的使用,季蹦忙蝴抱试纂催兑顶剪共惕擂元鬃聚操哺抖凝汝丘狗茎族依吻柴叔哨柄生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,通过实验现象说明鉴定的结果，由结果进一步说明你的提取物是什么？ 计算RNA溶液浓度及酵母RNA得率，并判断样品纯度。 将组分定性鉴定实验结果交老师过目评分，然后清洗离心管，整理实验台，用具归位，试剂瓶从高到低排列。,结果与分析,长堵闲泅绝爬凰润谋惑吹韦逸诺侨酋者擞黍埋哩亏仙第归杆急羊画漠茁践生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,1、以酵母为材料提取RNA有什么优点？ 2、如何对核酸水解组分进行鉴定？ 3 、利用紫外分光光度法如何判断核酸样品的纯度。,捷口围皋淌沥酗股镊诸府情酗河究缨嗡钱币也普万挽彼缨搔老筒槽削朽慌生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1,
