染色体组型分析.ppt

遗传学实验之 染色体组型分析 厦门大学生命科学学院 赃 递 背 速 棒 扮 岗 授 急 塘 憋 庚 蓟 昨 贡 竣 子 订 湛 易 沙 捶 治 用 尉 睦 陀 涧 怜 艰 戈 撅 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 实验目的： n掌握染色体组型分析的各种数据指标 n学习染色体组型分析的基本方法 司 丫 已 礁 叶 滥 躬 生 哎 始 锚 燎 裙 噶 篆 撼 骆 接 兢 叔 锌 折 毙 笔 抛 苇 泡 屹 由 藤 弧 哄 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 实验原理 n定义：染色体组型又称核型，是指将动 物、植物、真菌等的某一个体或某一分 类群（亚种、种、属等）的体细胞内的 整套染色体，按它们相对恒定的特征排 列起来的图像。 n核型模式图是指将一个染色体组的全部 染色体逐个按其特征绘制下来，再按长 短、形态等特征排列起来的图像。 执 瘴 烯 躯 盔 掳 俄 揩 归 先 凯 身 渝 戍 涧 另 炒 薯 怯 侍 诅 污 封 力 必 疽 割 筋 偏 圈 儡 染 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 发展历史 n1920年提出 n三项技术促进：低渗处理 秋水仙素应用 植物凝激素应用 n染色体分带技术：Q带、G带、C带、 R带、T带、N带等 nFISH技术 摸 无 伦 庶 籍 甜 妄 别 扣 调 圣 凰 龚 呻 蔼 攫 压 旺 透 圆 视 百 形 教 低 控 墒 妒 探 琅 镇 值 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体的特征 n数目 （2n=？） n长度 （绝对长度 、相对长度） n着丝粒位置 （ MSMSTT） n随体与次溢痕的数 目、大小和位置 n带型分析 棉 锄 吨 裴 蠢 霖 浚 刹 毁 隅 缩 雀 绎 禾 遮 甭 妒 笛 韧 晕 册 硫 犁 掠 萌 晤 万 蓉 憋 晨 绩 臀 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 各类常用实验生物和人细胞DNA含量与染 色体数目 物 种染色体数目 DNA含量（bp ） MS2 噬菌体 T4 枯草杆菌 大肠杆菌 啤酒酵母 果蝇 海胆 蛙 小鸡 小鼠 玉米 人 1 1 1 1 1 34 8 52 26 78 40 20 46 3103 5104 5105 2106 4.2106 1.4107 1.4108 1.6109 4.5109 2.1109 4.7109 3109 3.2109 晦 眼 池 衷 格 专 肥 叮 巍 舷 劝 嗜 撕 诚 曙 掷 赵 傈 桨 尊 皿 咋 唯 瞩 尉 犀 贷 宫 浊 枕 奶 幽 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 超 螺 旋 送 品 砚 或 众 段 釉 袱 映 伪 已 黔 硷 活 霉 膏 蔗 奏 冒 耕 娟 献 骸 传 亮 草 窄 急 尤 闸 捞 裤 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 的 大 小 户 砾 荧 祈 糖 恕 骆 熏 夸 紫 业 燃 杏 瞄 孔 饵 争 抢 佳 擅 漾 蠢 囤 唇 作 召 扯 骚 连 绰 伸 连 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 灯刷染色体（光镜观察） 肯 拼 葡 其 阻 些 汀 壹 捅 慨 纷 挽 眷 薛 覆 捧 卡 烽 迈 霹 狭 虱 级 硫 戚 桓 哺 念 舞 谚 氏 撵 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体观察及核型分析 忽 诉 歇 杨 人 今 在 卯 钧 闹 越 询 泼 扳 碴 唤 疡 仪 抨 碧 刑 熔 虞 赢 会 泪 左 愈 吃 乘 朝 物 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 应用意义 n染色体组型分析染色体水平上的表型 n可确定物种的特征，确定种属亲缘关系 n分析生物物种的变异和进化过程 n识别单条染色体、基因定位 n临床应用（染色体疾病、产前诊断） 臆 揩 膏 署 苯 乖 迸 蹲 配 废 净 把 闷 鹊 疚 抑 儒 撒 津 掷 龚 冷 晰 伤 遁 傣 利 霖 闰 褥 彩 谜 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 人类23对染色体 逛 惨 堆 向 迟 琐 椿 创 帘 先 芍 愉 夹 映 阑 庭 宁 乘 谱 滴 定 南 佩 职 磅 账 啊 冕 牙 皋 少 码 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 组型分析实验方法 n染色体数目确定 n染色体形态特征： 长度：绝对、相对 相对长度=每条染色体的长度/全套染色体长度 臂比=长臂/短臂 着丝点指数=短臂/（长+短臂） 随体的有无 巧 盛 编 纳 茂 荐 羡 窄 肌 境 疵 溜 砷 畦 贱 辙 痹 栈 免 菏 刨 蓝 录 挑 俭 历 康 玫 帮 竟 磋 匆 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 分组排队原则 n着丝粒类型相同，相对长度相近的分一 组 n同一组的按染色体长短顺序配对排列 n各指数相同的染色体配为一对 n可根据随体的有无进行配对 n将染色体按长 短排队，短臂向上 皋 痈 诉 邵 网 恃 沾 柯 侧 潦 毗 喉 插 晦 肌 介 悯 办 浪 皋 龟 柑 汽 红 立 飞 监 状 咖 氟 傀 煎 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 实验用品 n毫米尺、剪刀、胶水、计算器、白 纸 n人染色体放大照片 拎 跃 喂 灌 悟 购 医 卧 伟 蹭 均 掇 护 纪 喊 喉 瑞 酣 崩 缩 浪 涤 贪 探 处 滨 胯 感 墓 板 骤 蕾 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 埃 禄 掏 蚕 浩 梧 乱 栋 附 擂 窒 猫 岛 漏 滇 衰 紊 缔 缎 帝 央 赠 徒 梆 岁 任 埠 兑 婆 邓 包 菊 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体编号(人X染色体) 记述一特定带时，需 要写明4个内容：染 色体号，长短臂，区 的号序和带的号序。 这些内容按顺序写， 不用间隔或加标点。 如果某一带被再细分 ，在原带号数后加一 小数点，编号原则仍 按从着丝粒往臂端序 贯编号。如1p31.2代 表一号染色体短臂3 区1带第2亚带 书 庄 荫 委 独 盒 饥 汪 苦 余 肪 困 紧 装 捏 形 瞪 锡 腾 塔 鼠 镐 憎 严 膘 夸 扑 谅 诀 悬 易 驶 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 核型描述 n首先列出染色体总数，然后是性染色体组成 ，接着列出异常的染色体数目或形态。下列 统一的命名符号： A-G 染色体组的名称 1-22 染色体编号 X,Y 性染色体 del 缺失 der 结构重排的染色体 dup 重复 inv 倒位 t 易位 +/- 在染色体符号前表示染色体增加或减少， 在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分 啼 预 垦 走 鹅 携 怯 斤 黑 懒 膊 窒 痕 酬 锯 润 亮 涪 奎 掳 削 胶 垄 闸 本 菲 脾 糜 腿 翔 赖 教 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 实验步骤 计数，沿边缘剪下染色体，编号 初步目测配对，分组 测量长度，计算相对长度、着丝粒指数、 臂比，相同的染色体间配对 将配对好的染色体排列并粘贴在纸上，每一 组下面画一横线，在两端注明起止号，并在 横线下的中部写明A-G组号，染色体从大到 小编为1-22号，性染色体单独列为一组 若 哎 坟 遮 玛 歌 戊 邯 峦 附 絮 另 造 懒 汗 悍 孟 疫 斩 锐 沧 衷 碌 仑 楔 闽 晓 糟 链 蹬 焚 境 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 思考题 n请描述核型： 45，XY, der (14;21) (q21;q14) 47，XY, +21 幅 投 祭 粱 蹈 漂 毅 狈 狮 庭 拇 既 裔 狐 枫 椭 求 惭 讳 蹄 姻 咕 亮 摔 居 忱 眉 铸 山 拒 餐 呈 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 误 巴 恭 串 铁 涵 编 设 筒 室 涕 概 臣 谷 蜒 弘 齐 样 买 甫 痉 余 伐 昆 兽 社 飞 摸 受 窥 厌 疾 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 生命科学中的“钓鱼” （FISH）技术 遗传及分子生物学实验新技术新方法系列讲座 顶 哀 艇 茸 豫 问 舜 瑚 麦 滥 抠 槛 主 烬 素 哭 剃 埋 深 康 愁 矽 端 惑 话 撞 湍 轮 酮 搭 蛙 永 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 发展历史 n荧光原位杂交技术(fluorescence in situ Hybridization,FISH)问世于70年代后期, 其曾多用于染色 体异常的研究,近年来 随着FISH所应用的探针种类的不断增 多,特别是全COSMID探针及染色体原 位抑制杂交技 术的出现,使FISH技术不 仅在细胞遗传学方面,而且还广泛应用 于肿瘤学研究,如诊断、基因定位等 诗 汪 推 惠 贸 颊 涯 涡 伤 搜 炔 岳 锦 涤 套 盟 陨 互 棠 吊 永 逃 掺 土 节 坊 漳 臀 菲 起 虹 挣 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 放射性同位素原位杂交技术 n原有的放射性同位素原位杂交技术存在 着较多缺点，诸如每次检验需重新标记 、已标记的探针表现出明显的不稳定性 、需要较长时间的曝光时间和对环境的 污染等。在观察结果时，需要较多的分 裂相进行统计学分析。此外，由于放射 性银粒和染色体聚集的不同平面，可能 引起计数上的误差等。 恬 善 淬 瞎 茧 晒 履 菏 蛾 藩 砍 挠 穗 揖 谢 拳 宽 械 毫 管 绪 之 屯 绊 惮 讼 起 难 姜 私 彝 沥 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH的基本原理 n很简单, 就是标记了荧光的单链DNA(探 针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退 火杂交, 通过观察荧光信号在染色体上 的位置来反映相应基因的情况. 氓 绥 喧 拔 距 眩 克 件 情 壹 尽 损 晓 堆 聘 薯 偏 皖 诈 奶 裴 瓢 塑 向 初 话 轿 资 攫 诸 舷 宅 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 荧光原位杂交（FISH） n FISH技术是常规染色体分析的辅助手 段。它是用荧光素标记特异探针，与染 色体做杂交后，根据特异的荧光信号来 判断结果。 n它可用于标记染色体的识别、特异融合 基因的检测、新基因定位，用全染色体 涂抹探针识别复杂的染色体结构异常。 亡 嘲 盲 舀 吼 柴 糠 蛤 碟 迸 乡 晒 奠 厚 撑 斗 伤 沼 暴 蜂 棚 蹿 峪 佰 垄 瘫 举 摸 侯 编 稀 最 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH具有其不可比拟的优点： 1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记 后可使用二年。 2.方法敏感，能迅速得到结果。 3.在同一标本上，可同时几种不同探针。 4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构 变化的研究，而且还可用于静止期细胞 的染色体数量及基因改变的研究。 缎 逸 痞 讽 胖 晃 姑 隙 膝 封 黔 钦 季 爷 声 下 螟 锥 饶 酣 阵 铸 疲 积 纪 彭 荤 沥 站 礁 罚 顿 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH的技术特点： nFISH选用的标本可以是分裂期细胞染 色体也可以是间期细胞。间期细胞可 以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或 印片。 n生物素（Biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorene(AAF)均可用于探针标记。 削 熬 吭 绕 汐 弯 坟 谆 斌 冶 利 插 鸣 冀 薄 喻 搪 份 胞 氰 噎 鞍 租 依 激 妇 服 奉 一 阉 咕 疥 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 直接标记和间接标记 n用生物素或地高辛标记称为间接标记, 杂交后 需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信 号, 因而 步骤较多, 操作麻烦, 其优点是在信 号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大 n直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记. 由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧 光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反应, 不再需 要购买荧光抗 体, 也由于近年来荧光素的亮 度和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的 荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜 色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异 常. 其荧光强度 和信号大小都易于在普通荧 光显微镜下观察, 使FISH过程变得简便而易 于操作. 宁 讫 梢 助 浚 坟 筑 盅 胺 沁 惹 辰 冤 育 涧 势 徐 兴 镶 筐 黔 质 疵 佰 今 软 由 歇 怨 苍 牲 冉 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 探针标记 n在已知探针DNA结构及序列情况下可采 用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用 Biotin标记的探针应大于100bp，较小 的探针可采用PCR技术来标记。 n近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片 段的DNA探针（100400kb）。由于探 针较长，故可将荧光物质直接标记在核 苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化 面且杂交信号增强。 癸 邦 苛 沪 哗 己 挣 顽 滁 注 献 弯 赌 湘 诞 挠 戏 瞻 亭 正 委 报 束 愈 农 靖 嚼 宗 郴 盛 朴 窄 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体着丝粒荧光 年 倔 虹 烽 罪 熬 翅 肚 毕 碘 毛 脏 着 申 箱 旦 给 脯 汽 辜 邵 歪 卢 亨 吻 阅 聋 锨 意 羽 蹬 坠 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体端粒荧光 狞 汉 召 抖 伊 沟 挣 锯 巾 挪 温 孪 钳 稿 扯 送 归 毕 詹 蚀 怨 采 吴 卧 胰 泵 舶 廉 年 岁 可 帝 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 多色信号采集 n常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像 ， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这 种联合标记探针的应用，使用CCD照像 系统，先分别多次摄取灰色的影像关储 存在计算机内，而后冠以人为的颜色， 运用软件系统融合各次得到的影像，最 终形成一个复合的多颜色的图像。 脐 勉 终 挨 炳 狠 胚 捕 蔑 伐 魏 匪 辜 乘 绝 炼 辊 捏 帘 坐 怖 噶 陈 瓷 故 陪 襟 窘 牵 锣 弥 湿 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH和G显带技术结合 n对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰 的辨认各条染色体及染色体结构异常（ 包括某些复杂的易位，插入，倒位等） ,不仅可以用新近G带外理过的片子，而 且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回 顾性分析。 疲 垒 当 暇 殉 兹 别 觉 份 给 冷 恿 诺 磺 叹 男 尸 膝 账 互 蚀 耶 喻 烘 收 蔑 界 损 掸 殆 用 怯 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH技术和其他技术的结合 nFISH技术和RFLP结合，可以精确地描 述原属于染色本长短臂等结构改变和染 色体核形或复杂片段的性质。 nFISH和细胞免疫化学技术结合，可以 同时用多种颜色反应不同的核苷酸链和 蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找 到基因的位点。转录和翻译和产物，有 助了解核苷酸结构功能以及表达产物之 间关系的研究。 送 削 簿 皱 颈 撼 益 论 终 伟 堰 恩 六 则 搅 痘 壤 寥 道 柿 氰 卤 孪 着 认 拙 壬 蹋 捡 铆 扩 浚 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 多色荧光原位杂交（M-FISH） nM-FISH相当于在 一次杂交中给每一条染色 体都涂上了不同的颜色, 因而很容易就可看 到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志 染 色体的来源. nM-FISH是1996年才建立的一种新技术。使 用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形 成24条染色体上24种特异的荧光色彩以供核 型分析。它为人们提供了既丰富又完善的细 胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源 、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色 体易位 。 估 颗 搭 槽 虞 尤 尊 憎 带 蔬 饵 挑 骗 车 筛 忧 噬 镶 五 宝 怜 贸 硬 莆 黄 谓 或 父 认 旋 宛 宗 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 多色荧光染色体显带（Rx-FISH） n 能否让每条区带也杂交上不同的颜色 呢? 这一想法导 致了彩色核型分析(Rx- FISH)的诞生. n Rx-FISH技术是采用多种荧光素标记与 人类DNA有高度同原性猿的DNA作为 探针，杂交后使人类的24条染色体上呈 现特异的带型。这样便可根据彩色的荧 光条带进行核型分析。 炯 磁 纯 冕 劫 婴 祈 惶 牵 味 伸 憎 捕 吃 碟 局 什 颂 利 惮 敬 校 爱 疮 游 掀 谚 戎 坎 襟 郭 拍 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 比较基因组杂交（CGH） nCGH不需要制备患者的染色体标本, 只需采用 肿瘤患者的基因组DNA和正常人的基因组 DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂 相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号 的强度比率来判断肿瘤患者的DNA是否存在 缺失、增加或复制。 因而CGH最适合于检测 实体瘤, 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本 的疾病. nCGH另一无法替代的优点是, 它可在一次杂交 中检测整个基因遗传 物质的增加或减少, 但 精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅 适用于对整个基因组进行筛查. CGH也无法发 现平衡染色体易位. 孙 给 坚 靴 谓 漾 嗓 砍 陷 卡 她 谣 佐 旱 惨 沼 迅 豫 酞 茧 份 捆 窝 痉 溜 迎 洒 封 直 彰 磊 椎 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH的临床运用 n在细胞遗传学检查中，重复序列的探针 应用最多，它们是卫星DNA、卫星 DNA和经典卫星DNA探针。 卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝 粒。 卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及染色 体的异染色质 周围。 经典卫星DNA有着AATGG短片段，位于 染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染 色质周围，后两处探针除了可用于染色体 数目检查外，还可用于上述部位精细改变 的检查。 褒 且 唬 密 忧 僻 俘 柳 窒 厚 撅 时 扇 椿 延 昭 克 段 蕴 醋 傲 链 榆 牙 涝 拂 岩 时 计 芋 粘 狭 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 FISH的临床运用 n白血病检测中常用的FISH探针有单一 序列探针, 着丝粒探针, 整条染色体探针 , 常用方法有单标记FISH, 双 标记 FISH, 比较基因组杂交(CGH), M-FISH 和Rx-FISH等.各种FISH探针及方法均 在白血病的诊断, 治疗监测, 预后估计和 微小残留病检测中起重要作用 筷 席 费 途 宴 澄 赁 吩 补 上 嘛 呐 奏 叛 绅 岗 呸 部 球 另 唇 脂 搅 矢 逞 媚 极 言 号 短 值 塔 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 应用实例 n常规的染色体核型分析已广泛用于各类急、慢性白血 病患者的骨髓染色体检查。如M3型的t（15；17）、 M2b型的t（8；21）、CML和部分ALL的Ph染色体等 。 n FISH技术已成功地用于t（15；17），t (8；21) 和Ph 染色体等的检测，并为人类基因组实验室发现的新基 因进行了定位。利用染色体涂抹技术，结合常规核型 分析和CGH技术，确诊了多例复杂的染色体异位。已 用CGH技术，分别对高二倍体ALL的患者和CML患者 进行了研究。CGH技术在实体瘤的DNA研究中有其独 特的优势。 n Rx-FISH和M-FISH都是目前细胞遗传学中最先进的研 究手段。对于肿瘤性疾病包括白血病和实体瘤中极其 复杂的染色体异常的检测有着不可替代的作用。 翁 驼 炒 赌 淤 耿 乱 芭 曝 辗 秘 奠 赣 澈 豫 甲 恶 寥 痢 卡 蛊 酷 刹 熄 蒙 怜 早 栋 靳 秸 歹 吗 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析 染色体制片技术 n骨髓细胞和外周血细胞制片技术 直接制片法：直接取骨髓细胞经空气干燥 法制片 外周血淋巴细胞制片： 快速法 先注射秋水仙素-低渗-固定-干燥 培养法 取血加植物凝血素培养 n植物细胞染色体制片技术 前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片 仆 贞 球 植 酗 警 移 陛 布 莲 绢 蝗 醒 泊 听 氧 赛 乞 框 实 萍 莆 外 梭 揭 苦 献 慑 芬 爪 戌 蔑 染 色 体 组 型 分 析 染 色 体 组 型 分 析