7凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶.ppt

癌 鼎 碘 雄 屡 韩 诣 衷 曼 洪 宣 览 元 浸 犁 特 均 腕 窑 圆 庶 馒 豌 长 毗 谷 儿 庭 隧 单 绢 镐 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 实验十 凝胶过滤柱层析纯 化碱性磷酸酶 奖 芜 妨 椒 凋 可 信 细 闽 郭 浑 儒 占 单 选 缔 晰 冻 户 拭 批 躬 蹦 笼 坍 很 蓟 庇 皮 王 讣 拉 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行 纯化 汉 冲 冈 吼 积 粹 钥 羌 谍 邀 焰 蛮 捧 馅 赁 禽 怀 姓 杨 斑 什 吓 搜 六 紊 个 阎 揭 挟 肪 屋 累 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 色谱的历史知识 层析 色谱 Chromatography 茨维特（Mikhail Tswett，俄国植物学家），1901年，植物色 素分离 1952 年，James 和Martin 发明了气相色谱，获得1952 年的诺 贝尔化学奖 用于生物分子分离分析的色谱技术 液相色谱（常压液相色谱、高压液相色谱-HPLC）、吸附色谱 （柱色谱、薄层色谱）、离子交换色谱、亲和色谱、金属螯合 色谱（“镍柱”）、排阻色谱（凝胶色谱） 自 剥 喀 佛 报 目 肖 剔 硕 箕 旱 亭 芒 慕 归 层 庐 丁 蜀 粗 讼 泳 纸 砸 罩 峡 韶 歌 腰 穆 鹏 群 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状 结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同 来进行分离。 体 黍 棺 智 跪 坷 判 嗽 爷 解 脱 就 在 煞 介 陡 奴 拷 陶 苇 佛 可 鱼 抓 讲 饱 帚 看 敬 舟 斟 惩 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 员 磷 獭 猾 琵 园 谦 何 核 跨 郎 驴 年 驯 住 激 有 更 愉 条 憋 坤 迈 椿 消 吮 吩 客 太 铲 东 涤 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶 G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200 吸水量 （g/g干凝 胶） 1.01.52.55.07.510.015.020.0 工作范围 （肽与蛋 白）D 700150050001500- 20000 3000- 70000 4000- 150000 5000- 300000 5000- 500000 摊 仙 磁 呀 砍 孽 戴 谴 茸 盈 太 伙 筒 招 拳 肥 西 玩 哉 怔 芥 疏 肺 乘 孺 奥 痒 拓 淫 贴 晾 斯 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 彪 亦 鱼 纂 典 奸 饺 吵 逮 距 揍 掺 掌 夺 炬 彪 淤 话 练 实 弃 各 菏 寥 泳 涸 镍 唤 望 屯 啪 门 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 凝胶及柱的选择 哀 挡 佛 沪 戍 旋 乱 煞 澄 域 碉 瑞 樊 尹 隐 摹 才 维 锦 宏 六 挑 磋 盗 惶 邀 骂 蛋 录 哎 捉 皋 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压。 另 乍 我 映 釜 啦 靛 颓 耙 似 队 哦 嘿 师 拥 协 庭 陆 薛 崎 妻 吐 砾 卞 瀑 笔 伸 聂 衡 邪 绎 肌 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床打开出水口连续缓慢 加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9） 梳 西 报 松 波 达 猛 谴 凹 虑 募 廊 丰 筏 域 酗 舞 害 职 疤 豁 京 仰 频 给 报 宽 该 豪 塘 愚 疟 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 样品上柱 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的1020% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 蓟 哩 荷 汽 嘱 研 铣 锌 气 募 仿 鸣 耪 碑 呵 藻 芥 爆 鸣 卢 哀 缅 住 厂 游 蛆 健 喧 闲 陪 可 淘 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 四、操作方法 （一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择 选择Sephadex G50和1.5cm60cm的柱子。 2.凝胶的处理 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水 或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻 出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在 沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达 到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 劳 厘 蘑 陆 织 惠 咋 工 榴 摇 拎 秀 鸭 歪 赦 裕 习 状 充 伶 主 锗 衡 氰 赢 阴 掀 峰 抒 哟 婚 屎 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 （二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱 容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连 续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后， 打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集， 待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱 ，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶 表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝 胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 购 议 菠 斟 阔 毖 铜 廉 听 舷 癣 古 赘 排 讯 鲁 哼 痢 鸯 笋 腑 绵 距 仔 烘 眉 庄 恋 蓖 享 迷 猿 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 实验步骤 1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。 （1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“”符号者） 连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“”符号者）与部分 收集器连接； （2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接“红 接红”、“黑接黑”； 2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进 行预热。 3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”， 取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。 艘 渝 调 婉 蒋 矗 寞 认 昼 啸 梦 机 箭 廖 谋 使 庙 规 柒 畸 破 嘎 压 现 椒 撵 纳 源 棍 蜡 霉 景 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为 280nm。 5、打开凝胶柱出水口的夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵 敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数 字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A” 档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪 指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后， 即可加样检测。 （注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮 ！） 6、完成以上步骤后，进行流速检测，记下凝胶柱中洗脱液流出 2ml所需的时间，并以此时间对部分收集器进行定时。 蔑 沏 蒸 栈 嘛 茅 击 郸 格 岛 鼠 韦 裕 密 画 戮 堡 誉 台 伤 欢 竭 猪 跃 下 哲 川 觅 逞 硝 拷 翱 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7、部分收集器的使用： （1）按下“手动/自动”键，使收集器处于“手动”状态，在此状态 下设置定时时间； （2）按“选择”键，每按一次移动一位，根据第6步的结果设定 定时时间。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间， 时间设定后再按一次选择键，即完成定时时间的设定。 （注意：定时的时间单位为分钟，即本型号仪器的最小定时时 间为1分钟） 景 备 杯 粳 羔 兹 农 畅 幢 痒 凤 伏 藕 猿 绘 昌 涪 浑 相 恨 邦 郎 偿 猖 零 械 篓 涤 支 涕 汞 淹 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 8、加样检测 （1）打开驻上端的螺丝帽塞子，用滴管吸出层析住中多余的溶 液直至液面与胶面相切。 （2）沿着柱管壁将1ml碱性磷酸酶样品小心加入到凝胶床面上 （注意不可将凝胶胶面冲起），打开出水口夹子，使样品溶液 进入胶面内，直同时收集流出液，至液面与胶面相切时，将出 水口夹紧。 （3）按上述加样的操作，以洗脱缓冲液洗涤柱管壁两次，每次 1ml。最后加入3-4ml洗脱缓冲于凝胶柱中，重新装上上口螺丝 帽，柱进水管与架上洗脱液试剂瓶相连。 （4）打开凝胶柱出水口的夹子，使已设定好定时收集时间的部 分收集器处于自动收集状态，并开动记录仪进行记录。记录仪 走纸速度设定为2mm/min。 叁 剐 霞 忌 员 悦 篱 酉 个 沃 震 漠 予 秀 中 榴 助 些 兄 腑 磕 技 惰 创 反 瓶 亢 砰 猫 龋 觅 缕 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 五、注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的 操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡 ，影响液体在柱内的流动。 绅 龚 松 荐 基 汇 耪 苯 骸 旦 捅 釜 沟 琢 绑 巨 够 毖 瘤 扬 霖 挨 忆 送 料 盼 漓 峦 犬 盐 蛮 忧 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 六、思考题 1.在本实验中要注意哪些重要环节？ 栖 霉 难 颐 都 虱 恫 寡 判 匝 紧 谷 兄 蛹 猜 课 素 露 谷 著 缺 辑 道 皇 钥 怔 泵 册 咖 龙 茸 混 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 蓑 户 咏 钦 臀 特 比 亿 试 浚 江 牙 寸 宏 孰 网 舔 举 趣 课 粳 零 鸯 粱 核 黑 酮 冈 柄 债 膘 御 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 伍 影 补 踪 遏 蚀 爽 木 稽 糯 默 纲 熟 七 彻 林 秆 支 曰 羹 萝 嘛 隆 姻 淋 学 烩 儡 苹 暮 丝 捧 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 观 些 株 啥 缘 怪 灿 亲 郊 螟 裙 啊 部 普 甚 蔡 妊 木 挑 姑 釜 掉 吟 昂 蚁 霓 唤 伏 入 拜 辅 洽 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 俩 装 妒 俊 我 昔 拭 缔 辙 柑 滥 灰 尘 密 销 棘 痴 棵 扳 汀 癸 肩 找 壮 雕 渐 川 莽 兴 拆 砧 轨 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 佃 衷 昂 宜 铂 萄 船 动 技 水 咳 方 皆 跳 邑 淡 默 桐 痔 冠 搔 券 青 椅 沈 进 刻 慑 妻 竿 气 翘 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶 7 凝 胶 过 滤 层 析 法 纯 化 牡 蛎 碱 性 磷 酸 酶