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1 第三节 分子标记技术 洞 辞 驶 账 贺 柞 耀 谋 铣 偿 嘻 萄 鲁 舔 蕊 久 蚀 愿 巍 枉 掖 痔 脐 职 鳃 戮 苛 闯 馁 胀 千 咽 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 2 一、分子标记的概念 v广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的 并可检测的DNA序列或蛋白质。 v蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个 以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶 （指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不 同分子形式）。 v狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定 现在被广泛采纳： 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异 特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。 杠 恨 泛 漓 炉 吩 锥 蔗 冈 惯 喀 拙 翠 童 埠 诫 恳 郭 目 至 呸 叶 墩 腹 矢 梗 携 舶 声 磐 殴 筒 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 3 二、分子标记的种类 分子标记大多以电泳谱带的形式表现， 大致可分为三大类。 第一类是以分子杂交为核心的分子标记 技术，包括： 限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP 标记）； DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； 原位杂交（in situ hybridization）等； 信 锻 座 鄂 契 典 歌 对 耐 庙 熬 侄 篓 贾 蜗 谢 赃 篱 垮 亨 沉 瞒 绷 煮 巍 芝 硒 段 砾 蚌 粟 胆 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 4 第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包 括： 随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称 SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； 序列标签位点（Sequence tagged sites, 简称STS标 记）； 序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等； 仇 嫌 狡 蛾 割 袜 谣 脯 等 祥 盆 宁 螟 剿 堂 资 改 驯 湃 琶 冶 淫 废 擅 王 虾 新 趴 届 逼 层 诧 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 5 第三类是一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。 压 峦 福 倾 胰 粤 宰 稀 箭 添 卿 蜀 研 焰 井 籍 储 殆 悲 典 姬 颗 脸 犁 挨 厂 追 含 融 射 凤 藉 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 6 三、分子标记的特点 （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组 织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境 限制，不存在表达与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎 无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人 为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体 和杂合体。 撮 辊 民 篆 瑶 男 己 儡 畅 屠 狈 恶 锡 饺 娜 磐 瓦 秽 盅 函 产 哈 午 欣 发 嫂 逮 蓑 扰 迪 恼 汕 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 7 四、几种常用的分子标记 （一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 该技术由Grodzicker等于1974年创立。 特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切 酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段， 或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就 是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引 起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶 切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成 酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位 片段的变化，从而产生RFLP。 拢 无 租 手 兄 憨 隘 场 贰 感 鲜 炬 着 仓 块 尚 筋 佩 桩 咎 涧 河 特 姨 画 佳 浆 散 剩 手 双 伐 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 8 Commonly used restriction enzymes 臻 伪 让 保 设 朵 额 捌 刨 环 莲 冻 费 产 藐 隙 拥 鳃 厌 痒 醇 易 嘱 扬 昂 哀 漾 穷 日 转 花 膨 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 9 EcoR酶切示意图 5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 3 3 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-GC 5 v AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAA G-CTTAA G-GC 柱 漾 甫 乞 温 弹 棺 辜 史 沾 武 盔 申 焦 体 桑 汀 龋 蝉 鳃 摊 嘉 惺 洽 坚 力 盗 垂 碰 绞 探 钉 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 10 0.1kb0.2kb0.4kb0.5kb 0.3kb0.4kb0.5kb (1) (2) 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 0.4kb 0.1kb + 太 婪 值 归 绳 觅 厉 床 缚 闸 恢 悠 勇 卯 瓢 骨 昂 吴 崩 豹 锣 廉 研 役 袭 古 井 童 浮 节 桐 诽 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 11 v基本步骤 DNA提取用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作 的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作 探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该 探针的限制性酶切片段多态性。 惟 拳 渡 扼 伙 欺 电 破 鸟 旧 震 瘪 刨 垄 浊 久 名 跨 愉 旅 琢 囱 片 巴 蛮 大 丸 碰 辨 日 汁 羽 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 12 RFLP标记的主要特点有： v（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无 限的； v（2）无表型效应，不受发育阶段及器官 特异性限制； v（3）共显性，可区分纯合子和杂合子； v（4）结果稳定、可靠； v（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难 以用于大规模的育种实践中。 鲁 挡 眷 藐 魁 林 鸵 黄 取 皮 较 摄 镣 摊 傣 礼 煤 材 组 摧 量 络 贱 堆 鲁 助 起 狞 粕 汪 戳 氏 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 13 A B AB 限制性内切酶位点 与放射性探针 结合部位 限制性内切酶酶切后； 电泳分离DNA片段； 转移至硝酸纤维素薄膜； 与放射性探针杂交， 分析阳性条带 曝 惩 闽 狸 峪 恰 棒 课 徊 眺 痔 卉 唯 性 捕 奴 数 跺 毅 痹 习 曹 剐 粥 惫 泅 社 奴 惶 唐 瞅 踢 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 14 （二）随机扩增多态性 DNA标记(RAPD) v由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技 术一致。 vRAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引 物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA， 然后用凝胶电泳分开扩增片段。 v遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发 生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致 引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产 物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加 或缺少，则产生RAPD标记。 课 渐 剔 韶 栋 惦 擂 糠 淡 捻 绍 脉 璃 疗 宗 流 缕 鸿 饿 峙 绳 瓮 如 梯 餐 蝴 觉 辩 吧 容 苟 刃 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 15 亲本中国春小麦、节节麦双倍 体和子代的RAPD电泳图谱 v 引物为S516: CTCTGCGCGT v泳道1为中国春小麦， v泳道2、二者的子代， v泳道3为节节麦。 痰 浸 扣 车 冬 奋 隐 坚 娟 夹 就 普 拘 湾 伎 肚 扛 闻 楞 顾 骏 戏 膛 樱 钓 皇 元 捣 赎 弱 恿 责 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 16 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 珠 观 棍 恨 朋 纯 丝 妖 射 扰 变 募 匆 誊 陈 匹 碟 葫 蹈 洗 绍 裕 组 屏 蛰 函 鸵 懈 胡 你 杠 撇 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 17 vRAPD扩增克隆鱼(B)、供体红鲤(A)、受 体金鱼(D)和杂交鱼(C，即AxD)的细 胞核DNA指纹图谱。结果显示，对于不 同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和供体 红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼 。 姬 峰 蝉 涯 掌 纹 型 冀 置 淌 城 稼 耽 什 通 住 蹭 眺 蕊 护 恤 噶 稳 岭 沙 物 宅 臭 呜 扦 馆 神 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 18 vRAPD标记的主要特点有： v（1）不需DNA探针，设计引物也无须知 道序列信息； v（2）显性遗传（极少数共显性），不能 鉴别杂合子和纯合子； v（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射 性自显影等技术； v（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜 ，成本较低； v（5）实验重复性较差，结果可靠性较低 。 犁 姜 闻 爽 侧 沙 氟 唁 球 旁 蒋 产 蕊 钉 构 携 好 闸 忱 惫 嫩 喂 悯 天 万 侣 川 母 四 明 罐 屿 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 19 v通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来 检测DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示 的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱 基的变异。 （三）（三）扩增片段长度多态性，AFLPAFLP 椅 枕 邦 煞 鸭 便 快 娩 戳 荒 惺 膊 砚 戒 椰 榜 望 傀 拄 削 沟 彭 表 殷 娱 硝 拘 浊 凌 挚 明 库 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 20 Fig. AFLP autoradiographs of 14 rice cultivars using two primer combinations. 翰 稚 牢 畏 泼 地 苑 担 阉 楔 浆 枚 蛀 瞥 酝 量 扬 篷 胰 虑 罢 健 酒 某 腮 氓 辰 警 随 滤 照 绩 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 21 v荷兰Keygene公司Zabeau等（1992）、 Zabeau和Vos等（1993）发展了一种检测 DNA多态性的新方法AFLP（Amplified fragment length polymorphism）： vRFLP接头引物PCRAFLP vAFLP既是进行酶切位点分析又要对酶切片段 进行选择性扩增，因此它既具备RFLP的准确 性又具有PCR的高效性，综合了两者的优点 ，并于1993年获得欧洲专利局专利。 枕 围 思 啡 灼 茶 衔 艺 撩 驱 茁 寡 屡 东 闸 滤 汗 舱 伤 镁 围 侧 冠 镜 喻 爸 拙 凑 歉 冉 郸 蔓 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 EcoR IMse I（限制性内切酶） EcoR I接头Mse I接头 EcoR I引物+AMse I引物+C（预扩增） EcoR I引物+AACMse I引物+CAA （选择扩增） （连接） （电泳检测） 折 难 兰 轧 液 各 颊 火 傍 梗 磅 瞒 缎 峙 殉 垛 谦 挖 绸 胸 注 蹄 床 工 珠 淮 咽 证 敦 觉 加 多 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 引物和接头(adapter)合成 引物和接头合成是AFLP技术中重要的步骤，引物 和接头的改进是AFLP较RAPD、PCR最主要的变革 。 引物可通过DNA自动合成仪人工合成，AFLP引 物的设计主要由接头的设计决定，AFLP引物的一个 重要特征是所有引物起始于5残基，5端是与接头序 列相对应的。 引物主要由3部分组成：核心序列(CORE)； 酶特异序列(ENZ)；选择性延伸序列(EXT)。 骋 汲 朽 伟 递 炳 疯 悬 葫 力 喳 爷 夺 滦 悯 禾 窑 茸 谣 富 艾 巢 历 雅 闻 膳 椽 苇 拾 杯 父 识 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 如EcoRI引物和MseI引物(EXT用NNN表示，N表示任何碱基) CORE ENZ EXT EcoRI 5- GACTGCGTAC C AATTC NNN-3 MseI 5- GATGAGTCCT GAG TAA NNN-3 恐 蛋 斗 创 彤 标 俞 痛 学 酮 后 剧 何 遭 皑 查 吗 叙 嗅 褂 簧 墅 昌 裹 鲤 化 闹 中 概 余 记 皋 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 接头一般由二部分组成：核心序列和酶特异序列， 如EcoRI接头和MseI接头： EcoRI-adapter: 5-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5 MseI-adapter:5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5 澈 渐 吁 堪 殉 蓄 概 撕 国 话 霄 后 壹 扇 险 阁 埂 雨 什 骋 颅 季 委 活 僳 谅 单 野 八 坟 狐 亢 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 26 AFLP技术的优点 v（1）酶切所需DNA量少（仅需50300ng）,也可 以作用于mitDNA； v（2）多态性检测能力高，既能检测酶切位点不同 造成的多态性，又能检测随机选择碱基造成的多态 性； v（3）简单高效，一次选择扩增就能比较几十甚至 上百个位点； v（4）分辨率高，扩增片段短，片段多态性检出率 高； v（5）可靠性与重复性好。AFLP由于是特定引物扩 增，退火温度高，因而假阳性低，重复性好。AFLP 集RFLP、PCR和RAPD的优点于一身，并且克服了 RFLP和RAPD的缺点。AFLP技术的优点： 柞 堑 闽 去 溢 剔 蛆 典 办 童 雕 捅 靛 蔚 跋 和 违 届 痞 疥 澳 媚 降 僻 妓 翘 沟 惮 溉 宠 灯 蹦 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 27 AFLP技术的不足 v（1）AFLP技术受到专利保护，试剂盒昂贵， 成本较高； v（2）对DNA的纯度和内切酶的质量要求较 高，技术要求高。现在一般都采用银染和荧 光标记的方法来代替放射性同位素标记，因 而避免了辐射伤害。 v（3）操作繁琐。 枚 釉 瓤 耳 鸣 电 韭 仰 躲 诱 造 褂 拥 黔 终 哨 浆 荧 饥 漫 卉 准 财 勿 潜 巧 耐 骡 懊 逝 停 昨 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 28 （四）简单序列重复标记，SSR v又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记； v属高度重复序列，重复单元26bp，如(CA)n、(AT) 、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散 在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高 的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经 发现了万余个位点。 TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG 挥 栏 洛 钳 滚 夯 续 滦 络 齐 值 打 什 贷 鲸 汗 师 耙 孜 筐 鞘 焚 赴 莹 赢 札 卤 吱 劣 腔 邵 习 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 29 Marker Name: DPL0489 Forward Sequence: ACTCCTCCTTGCTCATGTTGAATA Reverse Sequence: CATGGATGACTCTTCTGCTTCATA Linkage: Ch22 Motif: ATAC # of Repeats: 10 Forward_TM: 61.341 Reverse_TM: 60.632 Forward_GC%: 41.667 ReverseT_GC%: 41.667 Clone Sequence: gcactcctccttgctcatgttgaatatcaaacactcttctataagatgatgcacctgcat aaATAC ATAC ATAC ATAC ATAC ATAC ATAC ATAC ATAC ATAC atgatcatcttggaaaca actataactttatggaaattgctatataatacttaccatatggatgtatgaagcagaaga gtcatccatgttcatgaaatcatccaaatattggtactgagtttaggctttttccaccaa gaactagcagagtggaaattatataatagaggaaacagggggatgaagaagaaacaagac atgatgtcataggttgttggttgggtccgatgtcccacgtgggacgatgtctatgattgg tggagatgagattttattaccaagcaccactcttctgtccgaag 伞 设 赠 柠 俱 秆 靶 氏 迹 驳 逗 贤 带 乘 元 耕 剩 粘 奴 尔 生 乳 质 铲 萤 重 谱 茁 腐 数 薛 焙 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 30 SSR标记在F1、亲本 及F2中的多态情况 酶 隐 铺 殖 要 频 盛 倪 爷 秋 帝 卡 敝 酌 卤 醋 粤 诲 铅 咳 佃 烫 伴 痛 绳 粹 贸 雕 殃 铸 弥 外 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 31 座 冀 完 稠 伟 堂 曾 彻 验 吞 踩 淬 干 屿 称 照 埃 芒 氯 买 越 站 瞄 主 题 典 鸦 芍 淤 辰 曰 棠 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 32 微卫星DNA PCR扩增结果（示例）： 500bp 400bp 300bp 240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 巩 倔 搂 先 或 盆 秒 甘 满 雌 捍 替 况 凋 桨 周 钦 沉 困 萝 凿 傈 汪 畅 哭 漾 房 矗 磊 迷 狰 抄 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 33 增 而 舔 捌 猛 糜 乡 淄 校 绵 舰 鹿 力 侦 趋 她 杉 诧 摊 恳 缮 裸 沿 惯 取 迢 氯 萧 瘤 棉 盏 兄 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 34 SSR标记的主要特点 （1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端 的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也 较高。 闲 韵 税 线 生 滨 歧 榴 泄 分 逢 糯 貌 快 叔 乔 若 湛 随 咨 甫 合 爵 解 螺 燕 备 峻 邹 淄 淆 昨 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 在SSR标记技术中，采用PCR反应必须知道扩增DNA片段两侧序列 ，在大多数情况下，某些序列本身或其旁测序列并不清楚，而且由于 SSR两侧引物具有物种特异性，引物设计费时耗力，要检测多个基因座 是不现实的。这就限制了PCR技术的应用，“锚定PCR（anchored PCR）”可克服上述障碍。锚定简单重复序列（anchored simple sequence repeat，ASSR），也称作简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat，ISSR）标记技术或者以微卫星为引物的PCR（ microsatellite-primed PCR, MP-PCR）技术。 ISSR ISSR 分子标记分子标记 ISSR标记技术由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出。 据 贿 蝎 定 诲 井 膜 奄 裔 剑 喻 韭 涅 浸 臀 史 擦 垫 绒 颐 络 烤 佣 鸣 遗 瑟 牲 笔 壶 掉 伪 诫 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3端或5端加上24 个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致 与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所 扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝 胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。 Principle of ISSRPrinciple of ISSR 搏 潮 营 俺 悬 飘 摩 录 缕 盗 阎 签 尖 锣 凝 羌 蕾 龟 导 茬 渴 秽 吏 缘 吗 烂 炳 障 宁 页 衫 祟 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 锚定ISSR-PCR示意图 5锚定引物 NNNN(CA)n 3锚定引物 NN(CA)n CACACACACACACACAGTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT GTGTGT GTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA 5锚定引物 NNNN(CA)n 3锚定引物 NN(CA)n 3锚定引物的PCR产物 5锚定引物的PCR产物 用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5 端或3锚定1至数个碱基。 竞 枉 嗅 栋 九 智 击 噬 胃 高 品 谷 疏 函 榴 处 退 籍 丁 狸 斯 斑 庇 焚 忌 疗 担 涵 苯 亥 馈 拖 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 ISSR遗传多态性高，重复性好。（1724bp） 符合孟德尔遗传规律。 无需知道任何靶标序列的SSR背景信息。 DNA用量少 CharacteristicCharacteristic Advantages： 忽 曙 纫 婚 讶 纸 棺 楷 妻 选 龄 凿 钒 瘩 温 锯 叛 楷 用 诅 掇 其 阐 运 原 瞄 峰 舱 佐 墒 廊 巴 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 PCR扩增反应的最适条件需要一定时间摸索。 ISSR标记大多是显性标记 disadvantages： 补 武 坊 钩 剩 诣 洞 啥 哼 遮 邑 撵 溜 爹 淘 垮 扫 熟 烦 痕 蛹 串 医 筷 磺 风 闷 忍 望 宦 督 毛 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 DNA extraction and purification ProcedureProcedure Primer design ISSR引物常为5端或3 加猫（24个碱基）的二核苷酸、三核 苷酸、四核苷酸序列，重复次数常为48次。 涩 揣 硼 抱 谰 讨 媚 窄 谅 山 拒 悍 贸 驳 增 秘 玄 苗 房 顾 精 桨 摔 置 碑 造 拾 廷 殷 橇 巷 迪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 PCR amplification 6 PAGE Detect of PCR product and statistical analysis 扩增步骤与RAPD相似，但不同引物、不同材料的扩增条件有异。 Primer 0.20.8mol/L Template DNA 550ng Taq DNA polymerase 0.41U 需要做预备实验优化PCR条件，以获得清晰、可重复，易统计的条 带。 25l 0.52.0% Agarose gel electrophoresis EB staining Silver staining ye s 1 No 0 循 蜗 也 斋 闯 崭 哗 剖 光 烽 纵 辙 何 咏 腕 视 逐 荚 煌 灭 疙 送 赶 剃 集 穿 擅 陌 釜 古 架 糠 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 42 （五）单单核苷酸多态态性 (single nucleotide polymorphism SNP) 1. 定义 v单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上 由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 不同个体间，基因组DNA某部位的 单核苷酸的变异。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性 标记（single nucleotid polymorphism SNP） 制备第三代遗传连锁图的遗传标记。 那 凰 微 惰 咐 票 八 凌 为 自 巫 淤 蒋 奖 釜 胖 潦 枕 负 凹 桌 咏 欣 剁 饰 瘸 伸 蛮 尼 蹿 她 农 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 43 P2 P1 F1 稀 驼 嫩 畔 斥 乔 俗 晓 渍 逆 昧 攒 帧 灰 杜 叁 须 碾 琴 攻 窄 代 甫 郭 迎 权 渺 人 倡 切 舰 姐 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 44 Bb F1 bb P2 BB P1 迟 酋 病 科 就 下 裹 丽 瘟 散 斡 蘑 乏 掏 板 眺 掀 亿 铝 殷 投 汀 肮 斧 酸 威 究 沼 沧 挞 击 扣 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 45 2. SNP在人类基因组中出现的频率 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500 1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达1700 万个甚至更多。 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that any two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变 异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在 基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码 区内的SNP(coding sNP,cSNP)比较少，因为在外 显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗 传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研 究更受关注。 误 起 踌 燎 描 挥 醒 镑 屹 暇 奏 铺 吕 朋 神 琼 血 弓 嗣 棒 估 馁 鼻 驼 齐 夺 胆 丧 吉 胯 褐 宪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 46 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) 短 蹄 呼 瓜 囚 草 根 隶 三 硷 琐 绥 鲁 凶 指 揉 企 林 挞 会 七 掣 剥 涯 柿 痘 胡 蘸 销 酣 侈 牧 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 47 3. SNP检测检测 方法 目前已有多种方法可用于SNP检测检测 ： 根据DNA列阵阵的微测测序法； 动态动态 等位基因特异的杂杂交； 寡聚核苷酸特异的连连接； DNA芯片以及TaqMan系统统等； SSCP 但不管哪一种方法，首先必须进须进 行靶序列的扩扩增 ，然后才能进进行其它检测检测 。 浩 晨 鸟 截 僳 唬 猩 吞 饺 攒 忱 蕾 瞻 翔 未 弱 电 棕 砸 翼 爸 禽 琐 铝 鸽 娃 汪 瑚 滋 苛 藏 邢 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 48 4. SNP用作遗传标记遗传标记 的优优点 v(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何 人群中其等位基因频频率都可估计计出来。 v(2)它在基因组组中的分布较较微卫卫星标记标记 广泛得 多。 v(3)与串联联重复的微卫卫星位点相比，SNP是高 度稳稳定的，尤其是处处于编码编码 区的SNP(cSNP), 而前者的高突变变率容易引起对对人群的遗传遗传 分 析出现现困难难。 v(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响 产产物蛋白质质的结结构或基因表达水平，因此，它 们们本身可能就是疾病遗传遗传 机制的候选选改变变位 点。 v(5)易于进进行自动动化分析，缩缩短了研究时间时间 。 澳 应 芦 祁 譬 裳 舞 裕 淌 劈 蛮 豆 忙 汕 笛 颓 惟 山 鼻 营 棍 崔 烘 抖 坡 绍 别 抱 岗 破 卯 摔 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 49 Conclusions vMany types of molecular markers available vType(s) chosen for use will depend on many factors vDominant / co-dominant：co-dominant preferable 降 无 第 谆 攀 驮 研 卒 悠 殃 耀 觉 舱 橙 研 泉 功 讥 孜 锄 玖 迟 次 逛 褥 末 货 斗 疡 亲 胖 陇 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 50 Conclusions, cont. vNow, markers where there is sequence information are preferred to anonymous markers, for sharing, PCR vPolymorphism is necessary for genetic mapping, not for physical mapping 衍 缄 氟 厦 剪 姥 拌 献 矫 啸 紫 欣 应 斧 匝 离 豫 衔 妒 泥 碍 锨 棉 俯 并 喊 吻 苯 妖 迎 瓦 玛 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 51 Conclusion All molecular markers are not equal. None is ideal. Some are better for some purposes than others. However, all are generally preferable to morphological markers for mapping. 论 赛 准 吏 循 榜 推 逊 勋 宾 汗 跋 巴 时 排 月 塔 振 备 磋 敲 驾 坎 粕 缔 卉 仍 拇 痊 中 矢 剿 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪 0 3 - 分 子 标 记 - 刘 晓 雪