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食品微生物学 检验技术 刘晓庆 宾 态 恬 火 恰 豪 蜀 疫 陇 傍 桩 忧 症 纳 悲 刘 孙 块 灯 诣 歼 雌 您 纵 囤 炸 孺 眶 敖 躲 抉 腥 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 1 微生物试验方法 取样 培养基制备 灭菌和消毒 无菌操作 培养、计数 饮料微生物检测方法 国标：菌落总数、霉 菌和酵母菌、大肠菌 群、致病菌 企标要求 常见问题处理 坡 绅 陋 钮 豆 煽 蚕 浴 鳖 荷 该 畸 列 晤 拱 浪 燕 旬 辑 抚 搀 月 处 蜒 腊 室 桥 复 赤 窥 戒 小 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 2 取样 准备工作 取样工具：消毒，灭菌 样品存放容器：清洁、干燥 取样标签 取样注意问题 采样均匀 避免污染 标记准确、牢固 及时保存 若不及时检测应保存在4冰箱，最长不超 过24h。 漫 赫 厉 写 狸 儒 质 磊 郁 墟 踪 部 姥 仍 旗 杖 茸 证 遣 熙 法 搜 甸 斌 燃 额 谷 绢 怔 鄂 己 少 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 3 培养基制备 玻璃器皿的清洗 新购的玻璃器皿 将器皿放入盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离 的碱性物质，最后用流水冲净。 常用旧玻璃器皿的洗涤 确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后， 可按常规用洗涤剂进行刷洗； 带菌玻璃器皿的洗涤 凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿， 必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗。 赡 袁 御 饲 酋 纯 坏 伞 议 菜 嚷 辑 玩 涸 腆 乃 箕 锦 腥 铲 思 倾 象 村 袄 腥 丈 盎 碴 刊 石 算 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 4 培养基制备 为满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含 碳源、氮源、水、无机盐、能源和生长因子六大类 营养 物质。 购买：选择质量好的培养基，注意保质期，记录收 货期。 贮存：30以下，避光保存于阴凉干燥处，使用 后，拧紧瓶盖，避免吸潮、氧化或污染。 保质期：一般未开封的培养基可保质年，已开封 的可保质半年。建议在瓶体注明开封日期。对于个 别极 易变质的品种，建议冷藏保存，可延长保质期。 冶 媚 疏 缩 炔 纠 瞒 移 史 困 皿 宜 论 草 凸 吐 蝉 镍 铺 演 麻 郧 彬 捅 玄 华 绘 凝 迹 鹰 胎 读 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 5 培养基制备 培养基分类 根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区 分： 天然培养基 是利用各种动、植物或微生物的原料，成分难以 确切知道。主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、 玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。这种培养 基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 合成培养基 是用已知化学成分的化学药品配制而成。化学成 分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以 它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分； 或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即 成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生 产实践和实验室中使用最多。 窟 被 溢 匪 态 慰 污 今 仍 拍 博 抿 爪 眩 宾 灰 球 棘 绎 液 得 孙 枢 纳 烈 努 染 山 栋 豁 园 理 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 6 培养基制备 培养基分类 根据培养基的物理状态来区分： 液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶 于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀， 易于控制微生物的生长代谢状态。 固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养 基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最 为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就 制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2-1%之间 。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏 菌种。 庸 涡 赎 均 慌 踪 逃 坊 刺 椭 向 坤 陆 诚 诊 沾 秒 庙 菲 斜 染 覆 造 蛛 浩 讽 轻 尧 忆 裁 梭 笆 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 7 培养基分类 根据培养基的用途来区分： 选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的 菌种生长的培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生 长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶 紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。 增殖培养基：常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲 ，增殖培养基也是一种选择培养基。 培养基制备 逊 王 级 半 烁 光 窟 妇 魄 茄 刊 院 耿 轴 钮 军 蒸 灼 遮 荡 逆 撩 躇 韵 贮 合 砌 玲 剿 思 壕 馆 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 8 培养基分类 根据培养基的用途来区分： 鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区 分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某 种微生物。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的 伊红美蓝培养基。 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用 的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具 有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（ 指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发 酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。 培养基制备 码 调 材 炽 烧 滞 实 缔 郊 褂 尸 褥 仗 滞 剿 缅 奸 同 丧 腕 纪 罚 棠 据 瞧 逼 赏 侠 读 字 磊 静 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 9 培养基制备 影响因素 洗涤剂中含有表面活性剂，会影响微生物生长，注意 冲洗干净。 一般不采用自来水配制培养基，因为自来水相对杂质 较多，有些含有较多的Ca2+、Mg2+离子，可与蛋白胨、 肉浸汁中的磷酸盐生成磷酸钙、磷酸镁，一旦高压灭 菌后，就会析出沉淀，从而影响到培养基的透明度， 不利于微生物的培养与观察。 蒸馏水或纯净水中所含的杂质较少，所制成的培养基 透明度高，有利于观察。 精 愧 珐 囊 烹 膳 曰 彼 戎 鉴 草 预 稳 踩 锑 叙 淫 梗 邓 袭 逼 缓 派 囊 洱 催 氮 佩 该 归 蔼 旭 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 10 培养基制备 制备： 准确称取各组分，一次完成，不要中断； 混合后，煮沸或者热水溶化，充分溶解； 分装，装量300，则可估读数 壁 若 疤 下 誊 葵 哺 赁 碟 傍 菌 贰 秘 骑 曾 密 撮 蹿 杰 挡 若 上 宜 故 告 处 馋 俯 镭 可 欲 码 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 22 饮料微生物检测方法 膜过滤法 标准平板计数法 棉拭法 显微直接计数法 食品卫生微生物检验国标 嗜酸耐热菌检测 致病菌检测 企标要求 剁 壹 碉 佳 蓄 纪 笺 丹 浆 劝 讶 撇 牛 风 广 晦 琉 将 曲 寂 霖 悍 晴 香 撩 抽 郊 宙 愤 瞳 稍 华 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 23 膜过滤法 使用范围： 可以过滤的样品 样品含菌量相对较少，一般300cfu/ml 优点：可富集微生物，更灵敏。 过滤设备消毒灭菌：121，15min 一次性无菌滤膜（直径47mm） 0.45m：细菌总数和大肠杆菌 0.8m： 霉菌和酵母 呸 碧 兢 疗 卸 头 独 请 瓜 简 纫 集 淤 狰 赋 昔 集 贴 叹 角 蔗 肢 棋 起 锄 耶 骨 漫 襟 情 葱 汾 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 24 膜过滤法 抽滤系统 真空泵缓冲瓶集液瓶三联（六联）抽滤器 抽滤 液体抽完后，空抽时间不超过30秒 可用20ml水冲洗，不可用洗瓶冲。 培养 在吸收垫上培养 在琼脂平板上 计数 直接显微计数 培养后计数 蔑 浴 绒 厨 遏 狰 浅 钳 报 腋 节 述 虽 丘 驼 既 美 慑 兄 谷 银 桌 掠 蜡 蝗 停 竖 候 发 减 卜 纲 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 25 标准平板计数法 适用范围： 难过滤的样品，滤过体积2ml，如含果肉的果汁和果汁饮料 空白对照 每一系列的测试至少需1个对照 培养基准备 在沸水中融化，置472 水浴中 步骤 在无菌培养皿中加1ml样品 在培养皿中倒入15-20ml培养基，注意：瓶口不要触及皿盖 小心混匀样品和培养基 水平放置凝固后，倒置培养 计数 且 练 乞 教 讶 咳 山 廉 皇 凭 谢 斡 查 烹 估 据 湍 矽 巢 侨 澈 贩 岂 刽 票 熔 唆 辖 析 峨 秸 寡 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 26 显微直接计数法 无需培养，最快的分析方法 用于糖的微生物评估 计数结果偏高 不分死活细胞，均被计数 食品颗粒与细胞不易区分 步骤 确定膜过滤面积和视野面积 样品溶液准备 过滤样品 染色 镜检计数 叉 斯 判 搏 熏 乖 匆 执 呸 功 玩 诛 翘 恫 办 骋 边 讹 饵 涧 滴 握 识 父 整 亨 桨 暇 像 狮 津 触 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 27 棉 拭 法 无法使用平板接触法的表面 柔软、不平整、不规则的表面 材料 无菌棉签 无菌水不平整 步骤 选择采样点，并作记录 在试管上作相应的记录 取出无菌棉签，在无菌水中浸湿 在待检表面擦拭，并注意擦拭孔缝 擦拭完毕放回无菌管中，盖好塞子 采用膜过滤法或平板法分析，在一 小时内完成。 便 纳 江 敝 及 辗 制 纺 壶 氦 湃 敷 玉 本 己 凸 夸 批 涕 屿 蔗 景 褂 脚 嘶 星 颧 馁 能 畔 冲 工 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 28 快速微生物检测法 ATP分析系统 ATP生物荧光检测计数法 直接荧光膜技术 拎 腋 叶 饰 彼 瘩 玻 闪 霓 嗓 量 删 各 哩 盖 坛 量 驼 霜 潘 衫 堪 州 盼 撞 浊 车 仟 痹 冰 现 痕 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 29 关于饮料的检验 GB/T4789.21-2003 冷冻饮品、饮料检验 采样：果蔬汁饮料、碳酸饮料、茶饮料和固体饮料：应采取原 瓶、袋和盒装样品。样品采取后应立即送检，如不能立即检验 ，应置冰箱保存。 处理：对于瓶装饮料，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石 碳酸纱布盖好；塑料瓶口可用75%酒精棉球擦拭灭菌，用灭菌 开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的饮料可倒入另一灭菌容器内 ，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后 ，进行检验。 检测：菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡 萄球菌、霉菌和酵母计数，均按照GB/T 4789 执行；乳酸菌检 验按照GB/T16347执行。 旭 绸 吏 性 狼 氢 勒 要 服 郸 蛛 猖 膨 荡 谈 抠 燥 叁 蚌 振 驮 欢 之 储 密 暮 晋 耽 溪 加 呜 寻 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 30 食品卫生微生物检验国标 GB 4789-2010 菌落总数测定 霉菌和酵母菌计数 大肠菌群计数 宗 牡 缩 狠 清 务 橡 叙 侍 窖 枝 抹 液 寓 羌 了 倾 绢 丁 誉 痹 歇 宰 烧 于 操 锦 御 等 饺 椎 步 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 31 菌落总数测定 GB 4789.2-2010 磷酸盐缓冲液 或生理盐水 吸管尖端不要触及瓶口或试 管口外部，也不得触及管内稀 释液。 吸管插入检样液内取样稀释 时，插入深度要达2.5cm以上, 调整时应使管尖与容器内壁紧 贴。 进行稀释时，应使吸管内的 液体沿管壁小心流加入，以免 增加检液。 每递增稀释一次，即换用一 支1ml灭菌吸管。 混匀时可先顺时针 旋转，再逆时针旋 转，旋转中应防止 混合物溅到平皿壁 和皿盖上。 检样过程中应用稀释液做空 白对照，用以判定稀释液、培 养基、平皿和吸管是否被污染 。 检样过程中应在工作台内打 开一块空白PCA（其暴露时间 应与检样时间相当），以了解 样品在检验操作过程中有无受 到来自环境的污染。 检样从开始稀释到倾注最后 一个平皿，所用时间不宜超过 20min。 如果把不能立即计数，要将 平板放入04冰箱中，但 不能超过24 h。 豢 户 隆 诉 强 氯 呵 芳 陕 谍 癸 脆 焉 绥 侍 绊 眯 凶 贾 丑 掌 啊 了 隋 攻 羡 厂 菜 岗 工 鉴 艾 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 32 菌落总数计数方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算 两个平板菌落数的平均值。 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最 高的平板进行计数。 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则对稀释度最低 的平均菌落数进行计数。 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释 倍数计算。 胎 瘤 捞 译 恤 弃 滨 啦 毯 酵 尾 渠 灵 眩 甚 胯 赚 贷 绣 琐 靶 乓 严 婴 超 狞 止 乱 律 罗 阮 而 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 33 菌落总数计数方法 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间，则以最接 近30或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 当有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围之内时，计 算公式为： N样品中菌落数； C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； N1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； N2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d稀释因子（第一稀释度）。 碾 瞩 鲜 魁 侨 赂 搔 耳 屿 昭 酒 箱 守 呐 海 徊 桔 哎 琵 狠 陀 空 系 忧 貉 晤 虞 偏 案 共 政 陶 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 34 霉菌和酵母菌计数 GB 4789.15-2010 稀释液为 无菌水 嫁 甄 勤 爪 汗 差 蝎 鼓 旺 内 逝 躺 谅 锯 渐 啤 旷 碎 霹 帝 蹭 绢 胺 瑟 抉 幻 榔 瞒 障 挤 菇 偷 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 35 霉菌和酵母菌的计数 选取菌落数在10-150CFU的平板进行计数。计算两个平板 菌落数的平均值，再乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平 板进行计数。 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则对稀释度最低的平 板计数。 若所有稀释度平板均无生长，则以小于1乘以最低稀释倍 数计算。若为原液，则以小于1计数。 报告时以CFU/g或CFU/mL为单位分别报告霉菌和酵母菌数 。 祷 浴 鲍 栗 沤 勿 岸 运 拴 寸 禾 笺 馋 被 通 绥 酗 姥 剪 景 丑 蛔 鱼 酬 缄 灭 狱 秽 撞 窄 箔 堤 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 36 注意： 霉菌次生菌对检验结果的影响 霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，霉菌有着 极强的繁殖能力，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或 有性孢子进行繁殖。孢子有点像植物的种子，不过数量 特别多，特别小。 霉菌孢子多聚积成团。在吸取各稀释度的样液时，需要 充分振摇或用吸管反复吹打，使孢子团分散开，并均匀 混悬。 霉菌在适宜条件下生长迅速，先成熟的孢子落在培养皿 上又可萌发长成新菌落，因此在培养的过程中观察，不 要反复翻转平板，以免有次生菌形成而影响菌落计数的 准确性。 茁 梳 垄 啦 铱 郁 禾 县 股 菩 疫 冀 汛 榷 补 罪 驭 狞 景 创 庭 省 胰 花 但 妨 笛 部 猜 迅 砍 地 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 37 大肠菌群计数 GB 4789.3-2010 大肠菌群指一群37、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来 源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫 生质量。 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是根据卫生学方面 的需要设定的一类与粪便污染有关的一组细菌。 大肠菌群中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，是 革兰阴性无芽孢杆菌，能在选择性培养基上产生典型菌 落。 颜 诽 胳 扁 散 逞 撕 溶 郴 咯 篆 戊 停 哇 梦 官 寐 晤 镀 憾 补 加 杀 吵 扭 绳 拭 歪 心 筒 睬 府 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 38 大肠菌群MPN法 GB 4789.3-2010 娶 北 衅 淀 往 逝 蜂 衙 泄 蛀 邱 绎 沛 努 辗 雏 晚 醉 锁 主 舌 殆 荐 霉 咀 检 侗 隅 党 骚 遥 蚁 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 39 MPN法注意事项 初发酵和证实试验： 初发酵和证实试验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否 符合大肠菌群的定义，即“分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管，并不确定就是大肠菌群阳性，经证实试验后可能 成为阴性。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验中，有时小倒管内会有极微小的气泡，有时可以 看到经初发酵培养后沿管壁有缓缓上浮的小气泡。可轻轻打动试 管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生。 在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生， 复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及 管壁却可看到小气泡。导管管口的完整情况与导管外有无沉渣存 在均可影响产气反应的观察，管口不完整性有利于气体进入导管 ，管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用其他稀释度，则表内数字 应相应降低或增加10倍。 砚 拭 望 唆 护 仅 往 泡 夯 蚊 约 显 斩 涛 霍 槽 雄 弛 含 钠 由 沫 饮 按 数 凶 盒 钦 元 裂 钩 乔 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 40 灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法 *原因一：过早打开灭菌锅 分析：当灭菌锅压力表示数为0，而温度还高于室温时，不要打开 灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低 ，试管内温度也随着降低，导致管内气减小，沸点降低，部分水 会汽化留在小导管内。 解决办法：等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大 时再打开灭菌锅。 *原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候） 分析：试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不 一致。在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力；灭菌锅 降温降压时，锅内压力小于管内压力。锅内压力会大于管内压力 时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡； 锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养 基报废。 解决办法：改用透气性好的棉花塞，或使用质量好些的橡皮塞， 切勿塞太紧。 凡 寺 嗓 狈 勃 磐 缘 浸 捕 厌 商 糊 碳 河 赦 张 侵 疑 鞍 渐 佑 情 氟 靶 敏 妓 烬 板 糟 柿 蜗 敲 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 41 灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法 原因三：小导管口太小 分析：小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来 ，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导 致气泡留在里面了。 解决办法：改用内空较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥 型管。 原因四：培养基质量引起 分析：由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压 分解产气的成分。灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基 组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。 解决办法：改用其它培养基。 原因五：灭菌锅工作压力不够，使气体不能排尽 分析：灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最 后还留有小气泡，还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。此 原因的可能性较小，我们可以在排除原因一、二、三、四的情况 下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就 要检查灭菌锅了。 解决办法：修理灭菌锅。 动 永 觉 遵 雨 些 酉 乡 昏 辩 肯 操 怒 慕 宁 荒 盏 去 策 地 云 朴 辐 焉 怎 病 吗 综 郴 戏 苦 旷 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 42 大肠菌群平板计数法 GB 4789.3-2010 拼 峪 手 嘴 黎 铲 渠 慑 寻 出 迄 龄 霹 婶 恿 淋 举 冈 九 陈 镣 铝 底 锤 酝 斟 娥 于 尾 裤 摘 支 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 43 平板计数法注意问题 全称：结晶紫中性红胆盐琼脂，煮沸灭菌，临用前制备 。 覆盖培养基的作用：防止菌落蔓延生长 计数范围：15-150 证实试验：从VRBA上挑取10个不同类型典型和可疑菌 落接入BGLB肉汤中，培养2448h，观察产气情况，凡 产气管者即报大肠菌群阳性。 结果报告：如10-4稀释液1mL，在VRBA上长出100个典 型和可疑菌落，挑取的10个接种BGLB肉汤管，证实有6 个阳性管，则大肠菌群数为1006/10104=6.0105CFU/g （mL） 际 恰 为 咎 冲 猫 毛 躯 哑 制 冷 乱 藤 喜 茁 晾 闷 搬 矮 马 赐 墒 眷 缔 巧 右 抵 授 芝 话 疾 骡 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 44 注意：大肠菌群的“假阴性现象“ 在接种发酵管时注意，要沿管壁缓慢加入，防止培养基中 倒置的小管里冲入气泡，造成产气的假象。 从平板上菌落特征不典型时应多挑几个可疑菌落进行染色 ，以避免出现假阴性现象。 大肠埃希氏菌典型菌落是呈紫红色、圆形、边缘整齐、表 面光滑、湿润、常具有金属光泽， 菌落周围有红色的胆盐沉淀环， 菌落直径为0.5mm或更大。 浸 殖 朱 恭 悸 戊 熬 辽 找 躇 曹 吻 装 轧 简 性 鸳 鼠 哩 蠢 椰 遍 喂 芥 郧 简 闯 匿 拐 戈 臃 问 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 45 嗜酸耐热菌检测 在pH值较低时，嗜酸耐热菌可以形成具有耐热性的芽胞 ，果汁生产中常用的巴氏杀菌难以将其杀灭。 芽胞以休眠的形式存活果汁中，当果汁复水后，适宜的 条件会使芽胞萌发，生长，从而导致果汁产品香气损失 、口感变差、浊度升高、形成沉淀。 值得注意的是，嗜酸耐热菌存在并不一定使产品变质， 未变质的果汁中也能检测到该菌，变质只在适当条件下 发生，一般会引起果汁香味损失及轻微浑浊。 佑 产 少 举 毒 妻 轨 敲 桌 厕 嚷 帚 根 襟 铅 拟 婆 裤 扑 蛰 谗 涨 椰 瘟 陀 炽 烧 岩 屏 外 和 蔼 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 46 嗜酸耐热菌检测 培养基：酵母粉或酵母浸膏1.25g，蛋白胨2.50g，琼脂粉6.50g ，葡萄糖0.5g，吐温80 0.5mL，500mL去离子水，121灭菌 20min； 10%苹果酸溶液，0.45m滤膜过滤后，121灭菌5min，用于 调节培养基的pH值； 当培养基冷却到50时，调节培养基的pH值到3.70.1。 倾倒培养基，每瓶15-20mL； 将样品（浓缩汁10mL，果汁产品100mL）放在801水浴锅中 保温，当样品温度达到80时，开始计时，10min，以杀灭样 品中其它不耐热菌。 冷却后，将样品加入到90mL无菌生理盐水中，混匀后用 0.45m滤膜过滤，将滤膜贴在提前倒好的培养基上； 43-45倒置培养4天 以CFU/10mL或CFU/100mL形式报告。 乌 做 泉 佣 八 赘 琶 更 塑 贵 蚜 讣 聂 倍 邪 吕 尉 司 庭 毙 逮 泼 逻 钢 蛹 菲 朽 燎 裤 骆 厕 礼 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 47 致病菌检测 沙门氏菌 GB/T 4789.5-2003 金黄色葡萄球菌 GB 4789.10-2010 志贺氏菌 GB 4789.3-2010 奏 传 仰 凯 温 猛 限 他 秆 芯 参 浇 币 坍 恕 夺 要 懂 姻 剧 柔 绪 豹 瞎 劳 讳 亢 较 卷 部 阜 麻 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 48 企标要求 成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009） 表1 水微生物指标及检验要求 产产品项项目指标标检验频检验频 次 原水、 RO水 菌落总数，cfu/mL100每周1次 霉菌酵母，cfu/mL5每周1次 大肠菌群，MPN/100mL3每周1次 瓶（桶）装 纯净纯净 水 菌落总数，cfu/mL20每小时1次 霉菌酵母，cfu/mL不得检出每小时1次 大肠菌群，MPN/100mL3每班1次 逢 舌 谜 唇 锭 膛 松 葫 褪 偷 淌 甲 梧 膝 眩 琶 工 谭 陋 勿 峻 凭 迄 续 奴 情 梅 茬 氓 灶 夕 颅 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 49 企标要求 成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009） 表2 饮料类成品微生物指标及检验要求 产产品项项目指标标检验频检验频 次检验检验 方法 料液*菌落总数，cfu/mL50001次/周期 GB 4789.2-2010 霉菌酵母，cfu/mL301次/周期 GB 4789.15-2010 饮饮料类类 成品 菌落总数，cfu/mL51次/小时 GB 4789.2-2010 霉菌酵母，cfu/mL11次/小时 GB 4789.15-2010 大肠菌群，MPN/100mL31次/班 GB 4789.3-2010 注：料液取每周期最后一罐料液进行检测 娜 颠 隅 粟 伤 瑶 找 邻 哗 口 栈 摘 国 株 阴 付 稗 辫 喜 虐 甘 峻 坐 陶 也 旨 魂 侄 氓 厉 硝 湾 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 50 企标要求 成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009） 表3 环境卫生控制指标 控制项项 目 控制点检测项检测项 目指标标检验频检验频 次 卫卫生控 制 人员卫生大肠杆菌阴性1次/周 车间环境菌落总数，cfu/平皿501次/周 霉酵总数，cfu/平皿301次/周 正压房菌落总数，cfu/平皿31次/周 霉酵总数，cfu/平皿31次/周 饮饮料类类 成品 无菌盖菌落总数01次/周期 霉酵总数01次/周期 无菌瓶菌落总数01次/周期 霉酵总数01次/周期 无菌水菌落总数01次/周期 霉酵总数01次/周期 冠 缀 绵 歇 哦 课 曾 彻 骨 蔗 睁 盏 隧 烘 污 揪 梯 团 灼 膊 抉 桅 课 颊 瞻 伺 芝 狭 书 柔 括 谨 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 51 微生物检验操作需要 注意的几个问题 微生物检测操作注意事项 防腐剂对微生物检验结果的影响 TTC溶液对微生物检验结果的影响 亡 厘 哗 是 挡 阔 滞 局 窥 常 粱 吹 洼 沫 藏 圣 茶 沥 鬼 铬 淖 祸 形 嫡 诽 起 梅 匪 谐 拜 朴 皆 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 52 微生物检测操作注意事项 检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并 在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留抑菌物质。 在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入 液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于 玻璃瓶或试管的内壁缓慢释放液体；当用吸管将检样稀释液加至另一装 有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液 ，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。 为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内 向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。 样品打开后应准确、迅速完成所有微生物指标的检测，这样既可以节约 时间，又能减少空气污染的机会； 样品多时应注意提高效率，实验结果的准确度，更要避免交叉感染； 帕 遁 踏 螺 缩 忆 誉 邦 茵 腻 麻 隐 贮 紊 幅 步 湃 系 习 感 声 迟 苛 椅 豹 著 佩 髓 掳 舒 亥 洛 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 53 防腐剂对微生物检验结果的影响 防腐剂主要作用于产品加工和制造过程中防止微生物的 生长。 假阴性现象：如果被污染的微生物处于受抑制状态，微 生物检验不注意稀释，往往会检不出微生物，出现假阴 性现象。 抑菌现象：低稀释度的平皿生长的菌落少，高稀释度的 平皿生长的菌落反而多。 穆 辈 笨 秸 统 鸟 撞 婪 名 众 绊 祁 泣 梗 姓 烬 圭 克 聋 鸟 础 郴 屠 纶 翔 第 卿 你 系 权 晨 筒 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 54 TTC溶液对微生物检验结果的影响 为了便于区别产品中不溶解的颗粒与菌落，可在每100mL培养 基中加入0.5%的TTC溶液1mL，如有细菌存在，培养后菌落呈 红色，而其他的杂质颗粒颜色无变化。 TTC分子式 C19H16N4 TTC分子结构如下 由于绝大多数细菌均含有脱氢酶，能使相应的底物脱氢，用 TTC可作为受氢体，使TTC接受氢后还原成红色非溶解性的三 苯甲臢，而颗粒杂物和气泡则不显色。利用这一原理即可区 别菌落、杂物和气泡。 已 确 宣 杏 陋 芒 碳 撤 内 攻 冷 姥 贯 识 缴 坞 忽 赖 痰 酗 众 段 瓜 滋 茨 莆 斥 袭 穿 矮 蛔 发 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 55 TTC溶液对微生物检验结果的影响 使用TTC溶液时注意： TTC溶液要放在低温及暗处保存，以免受到光与热而 分解，在使用前应在水浴中煮沸30min，待冷却后方能 加入已熔化的培养基中。 TTC也是一种抑菌剂，经抑菌试验证实，浓度小于0.2% 时对细菌生长繁殖无抑制作用，当浓度大于0.2%时对 细菌生长繁殖有抑制作用。 使用TTC时一定要注意它的剂量，不能随意地增加用量 。 解 雾 芋 募 掀 畴 气 诲 吮 贷 一 讨 垂 篡 糕 拍 喇 狄 捅 雀 液 酸 渠 潜 谢 阔 路 郸 撞 僳 昔 唱 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 56 综上所述 规范配制培养基 规范灭菌 规范操作 注意避免：假阴性现象、抑菌现象和次生菌现象 等。 这样检验得出的结果才比较准确。 忆 可 祥 紫 岂 池 牵 汁 锁 绪 皇 圆 拽 庞 谬 命 纷 阳 券 郡 货 袍 翟 蔓 拐 诊 舶 腥 谐 龄 顾 必 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 57 丙 馋 界 谅 箔 曹 烘 乓 倒 约 掂 匆 端 爽 包 寨 专 崭 烟 脯 眯 裤 稗 评 梗 绝 绒 陕 乙 熙 簿 惊 3 微 生 物 检 验 技 术 3 微 生 物 检 验 技 术 58