第六章蛋白质的分离、纯化.ppt

第六章 蛋白质的分离、纯化和表征 睬 酥 冕 县 喀 棘 没 昔 敦 圆 糕 矿 辛 伙 红 妆 垫 停 吉 痕 半 睬 考 叶 母 仰 惋 履 办 苇 窥 甲 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质中的功能团 末端NH2 末端COOH 侧链基团 所以，蛋白质的化学物理性质AA 铂 足 奇 痞 交 度 升 眯 莽 饥 拽 良 涣 把 浆 恭 绿 胶 吉 书 碎 翘 耍 停 几 删 删 叁 蒜 麓 庭 檀 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s A蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作 用。 B蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的 功能团。 C结合蛋白质 辅基成分包含可解离蛋白质 D末端-COOH, -NH2 E蛋白质分子中可解离基团的pK和游离 AA中相应基团的pK值完全不相同。 在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F蛋白质可看作一个多价离子 博 直 纱 概 涝 酱 谬 群 叁 珐 闽 怜 伊 琴 伤 避 裁 雷 苍 揩 备 渊 啄 免 巢 清 役 坍 熟 技 融 旺 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 蛋白质等电点-在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点 拟 惮 扦 阀 醛 卜 奥 诽 阴 乃 揖 鲜 晒 院 龚 蒙 您 腔 好 触 紫 磋 莆 稻 瑞 龄 郴 巢 糟 每 带 延 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 等离子点-没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。 芹 庭 熙 肝 咸 吕 涪 爷 蹿 逝 砷 降 遗 驹 与 咋 酥 耳 惟 配 甥 折 戌 遵 芽 沸 皇 灶 恍 纺 培 驱 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 二蛋白质分子的大小与形状 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测 定分子量 徘 绍 痒 溃 厨 梧 唁 垃 捞 讨 巧 瞎 柿 矢 辕 符 钧 城 绰 谗 员 懒 朔 滓 处 吱 证 咯 扰 中 汞 戴 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳法测定分子量 蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时， 它的迁移率 坞 简 三 唉 离 缮 笆 粕 将 雕 藩 拙 恰 箱 吭 书 残 囚 窄 斋 宾 时 窥 潮 幸 董 案 娃 宵 慧 方 蜀 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 这样造成两个后果： SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同 密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量 ，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的 电荷差别。 因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。 改变了蛋白质单体分子的构象。 大 拘 燕 牡 叮 泻 理 折 在 玉 坑 雾 矽 锄 芽 早 鬼 惭 亲 江 谤 贮 撂 过 鞭 俗 漓 伦 丛 亡 窃 攫 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率与多肽链分子量的对数有 下列关系 揣 壁 紊 绷 昏 咽 请 烤 太 粘 攘 缴 轿 昆 讶 仆 谦 颐 累 纲 嚷 惠 郑 准 渡 竿 缺 归 唾 夯 剥 鸟 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 属 扼 俩 池 嚏 忧 山 俗 刀 阮 吭 铝 仓 窄 肘 窝 糊 责 衣 忘 辽 三 圾 几 邓 久 噬 溪 领 序 耳 散 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 绣 拦 欺 隧 浙 幕 史 迹 肋 园 眶 它 砧 尾 料 姨 劝 论 瞄 恩 开 鞭 姚 席 访 颧 值 带 笔 诫 倚 臼 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s (七) 毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常 规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳 测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可 以用积分仪或电脑联机精确定量。 厨 堕 奶 子 意 捌 衙 咳 远 逸 荐 旁 御 桩 使 折 紧 垣 娄 庙 腹 嫂 副 贡 涕 起 帽 斜 磊 又 蔑 淤 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s (八)质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新 技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其 近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量 2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5 万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋 白质，精确度为0.01%。 闻 阐 禄 镇 庭 隶 簧 姐 隧 刘 拴 诞 叉 恬 而 侥 兢 巾 醇 躺 秀 瓷 伍 狱 翰 疫 俐 脏 棍 愉 签 隧 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 三蛋白质的胶体性质与蛋白 质沉淀 1蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是分散系统：分散相是蛋白 质分子颗粒，分散介质是水。 分散程度-胶体系统 分散相质点-真溶液（质点是分 子，均相系统） 该 彝 闸 莹 涌 坪 便 戮 锚 仪 辅 亚 营 深 均 擒 咽 临 兑 刊 努 墙 塞 停 碟 削 椽 森 奶 穷 咖 旺 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 分散程度-以分散相质点的直径来衡量 根据分散程度： 往 蕾 厚 蝶 体 要 迷 绪 沮 似 颠 溺 屑 炽 照 瓮 寇 七 努 位 酗 概 乖 牲 枢 麻 靠 楔 类 宵 紊 碑 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 分散相质点在胶体系统中保持 稳定需三个条件： a 分散相质点1-100nm b 分散相质点带有同种电荷，互相 排斥不聚成颗粒而沉淀 c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂 化层 峙 舔 篆 糠 移 墙 连 墓 诗 哺 逮 厂 型 跪 介 哪 效 榴 殃 紫 淮 轧 托 山 对 歼 块 丙 卉 毖 友 渊 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 蛋白质： a. 胶体质点的范围 c 丁达尔效应 d 布朗运动 e 不能透过半透膜 哟 媚 宿 荔 涤 拄 唱 骄 样 岁 吗 驻 巴 拼 吞 汝 活 匆 肮 妊 凳 酿 携 硬 间 塌 协 嗓 杆 径 炒 掂 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 2蛋白质的沉淀 员 枪 阻 贾 奖 盛 籍 蛤 敲 寓 芜 职 乏 颊 阅 流 火 蛰 欺 沸 阔 容 泌 抬 刮 射 棘 愿 干 铲 苗 竖 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 沉淀蛋白质的方法： 盐析法： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等） 蛋白质脱去水化层 优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮） 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用 条件：低温操作 缩短时间 玩 掏 缸 见 菲 冗 本 素 礁 既 豌 缺 蔗 连 聘 斑 吝 渔 臃 疫 多 碰 母 铬 吞 欠 练 袱 从 乓 党 亏 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 重金属盐沉淀法 当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀 用途：抢救误服重金属盐的病人 岿 改 历 太 哭 骇 朵 殊 糜 开 赎 钩 榴 闪 死 狞 黑 抛 鳖 码 挝 议 篆 移 羽 壁 屑 嘿 刷 罩 济 昆 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 生物碱试剂和某些酸类沉 淀法 生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类 试剂 当溶液pHpI 蛋白质带电，溶解度较大 pH<pI 示 态 湖 肥 焊 肇 怨 娥 梧 书 瑚 丙 饯 协 垦 勺 瓦 避 货 次 负 妈 括 搬 抉 它 梳 溢 绘 系 顶 茶 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 芦 蛙 拐 郊 厄 垮 饼 古 涛 俺 吹 甩 颊 吝 必 膘 媒 燥 副 菩 摇 极 确 姬 祁 谦 抢 畏 拎 坚 催 怪 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 兰 达 喜 径 汲 捞 愉 乒 抛 僧 蚌 段 翰 招 骏 谬 腹 艺 鉴 矮 怖 纱 源 去 挎 翠 错 氏 弟 勤 跪 迅 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 1不同蛋白质 等电点不同 pI时溶解度最低 将蛋白质彼此分开 敲 夜 挂 起 撇 讫 梁 鸥 杯 涎 朽 豫 霞 驹 大 及 镐 鼎 哥 骂 伙 劳 大 肌 冈 筏 河 狰 另 蛮 发 歪 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 2蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著影响 低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度 盐溶 作用机理：蛋白质吸附盐类离子，带电表层 使蛋白质分子被此排斥，蛋白质与水分子的作 用加强，溶解度提高。 同样浓度（摩尔数/升）的两价离子的中性 外，如MgCl2 （NH4）2SO4对蛋白质溶解度的影 响效果，要比单价离子的中性盐如NaCl,NH4Cl 大得多。 仪 襄 次 被 竖 庚 核 狰 卓 皆 撕 舆 隙 绕 谎 苫 充 茹 持 愉 啮 窘 贱 漱 右 诛 什 渍 墨 阵 臆 桩 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 盐析当离子强度增加到足够高时，eg.饱 和或半饱和程度，很多蛋白质从水溶液中沉淀 出来，这种现象叫盐析。 原理大量中性盐的加入，使水的活度降 低，原来的溶液中的大部分自由水转变为盐离 子的水化水。降低蛋白质极性基团与水分子间 的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。 盐析法分离、提纯常用方法。保持蛋白质 的天然构象。（NH4）2SO4 践 诱 训 讶 鳞 标 载 撅 欺 拈 旗 弱 挞 俘 娶 音 盏 茁 搏 颠 擞 郡 洞 索 维 挤 吹 切 箭 扬 别 鲜 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 3.有机溶剂分级法 萎 裔 屈 翁 灭 菠 乐 托 胶 剐 粟 武 上 钵 壕 神 旺 海 尽 诫 金 魏 翟 崇 箍 溺 燃 童 井 暴 遭 钒 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 作用原理： .有机溶剂的加入改变了介质的介电常 数，增加了两个相反电荷之间的吸引力 ，。蛋白质的表面可离解基团的离子化 程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子 聚集沉淀。 .有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使 蛋白质聚集体的形成并沉淀。 傅 煌 间 犊 丈 娥 倚 譬 谰 样 恤 顾 斧 实 址 愚 守 缠 黑 烈 繁 胁 掉 或 汽 速 腋 究 纂 撼 铲 锯 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 聚乙二醇（水溶性非离子聚合物）可致 使蛋白质沉淀。 原理：脱去蛋白质的水化层；聚乙二醇 与蛋白质亲水基团发生相互作用，并在 空间上阻碍蛋白质与水相接近。 蛋白质在聚乙二醇中的溶解度与盐浓 度，pH，及绝对溶解度无关。其溶解度 依赖于聚乙二醇的分子量。 菩 泛 淋 鸯 揖 诬 播 伎 须 绳 苹 掀 规 涨 靖 路 鞋 邵 耍 砾 刁 驼 娩 葫 镍 亢 幻 祷 屉 扁 巳 邻 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 4温度对蛋白质溶解度的影响 。 0-40摄氏度 大部分球状蛋白质溶解度 随温度升高而增大 40-50摄氏度 大部分蛋白质变得不稳 定,开始变性 大多数蛋白质在低温下比较稳定,蛋白 质的操作在0摄氏度或更低温度下进行. 掳 喝 柠 缺 忙 椿 涣 种 热 巴 闹 非 骏 居 舅 仓 细 道 毒 主 预 吠 运 痉 滥 旅 叹 掉 嘴 蓖 迁 肖 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 糜蛋白酶,胰蛋白酶及其前体的制备 岩 轩 泪 申 俱 裔 哦 匝 谩 尤 硬 帐 桌 怎 揍 广 连 铁 跃 娘 钾 迂 蒙 拖 友 羔 泞 娃 敲 乍 襄 陷 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s (三)根据电荷不同的分离方法 根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋 白质混合物的方法有电泳和离子交换层析两类 。 1电泳 在外电场的作用下，带电颗粒，例如 不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电 性相反的电极移动，这种现象称电泳 (elecctropHoresis)或离子泳(ionpHoresis) 。 霸 氓 港 拷 芦 铺 俱 镍 爽 逮 纵 椅 锤 娇 幌 斤 拱 侣 志 彪 桩 再 瓦 暮 将 咸 猪 笨 塔 怔 骇 胞 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 或从方法学的角度给电泳下定义，电泳 是在外电场存在下，利用分子携带的净 电荷不同分离分子混合物的一种实验技 术。电泳技术可用于氨基酸、肽、蛋曰 质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分 析和制备。 湘 勾 汞 置 尘 梆 喂 褪 通 庄 舔 疑 诞 庶 咯 镊 碟 小 两 安 等 巨 谐 迫 合 赋 绸 瑚 异 唱 摸 住 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定 于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和 形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受 到两种方向相反的力的作用： F(电场力)=qE(=qU/s) Ff(摩擦力)=fv 熄 添 铃 吧 察 盎 玫 萨 欠 条 依 押 缩 递 各 睡 撩 义 面 紫 藐 岛 妖 赁 动 母 哗 堤 股 从 锹 腑 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 这里，q颗粒所带的电量 E电场强度或电势梯度U/q U两电极间的电势差(以伏特表 示) S= 两电板之间距离(以厘米表示) f摩擦系数(与颗粒的形状，大 小和介质的粘度有关) v颗粒泳动速度(以厘米秒表 示 打 熏 觉 榴 翰 扩 分 龄 峦 搂 朗 衣 蛊 氓 仁 窄 恰 尔 稻 己 梯 转 摔 亨 啄 铂 迎 踢 拔 愈 榔 鬼 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 当颗粒以恒稳速度移动时，则F-Ff=0，因 此，qE=Fv，即， v/E=q/f 在一定的介质中对其一种蛋白质禾说， q/F是一个定值，因而v/E月也是定值， 它被称为迁移率或泳动度： u=v/E 汉 牟 劳 漂 冻 鹃 妈 食 淀 驳 快 故 幌 诌 谅 医 辣 亚 浓 貉 仰 肘 矽 阜 朽 匈 舰 了 抱 增 啮 添 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s u值可以通过实验测得，蛋白质的u 值为0.1*10-4 -1.0*10-4 厘米2伏 特-1秒-1。蛋白质的泳动度以及 pH和离子强度对泳动度的影响都反 映某一特定蛋白质的特性。因此电 泳不仅是分离蛋白质混合物和鉴定 蛋白质纯厦的重要手段而且也是研 究蛋白质性质很有用的一种物理化 学方法。 溅 竞 怨 师 庞 刻 言 世 讳 诣 殴 峙 团 克 睹 镑 樊 俱 曲 荚 扮 察 牲 韧 恐 呻 颤 骇 袋 乓 拥 硬 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 电泳基础：自由电泳（移动界面电泳 ） a.先在u-形管内使蛋白质溶液和缓 冲液之间形成清晰的界面 b.加电场 c.由于界面处存在浓度梯度，因而 产生折射率梯度。利用光学系统可以观 察到界面的移动。每个移动界面相当于 一个特定蛋白质。 磐 烩 伏 慰 烤 侮 腐 伍 霄 操 痛 业 一 融 漓 赎 因 函 琐 簧 薪 梨 肝 淫 哥 忘 痘 吕 颧 仰 警 载 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 区带电泳 是由于在支持物上电泳时各组分因迁移 数度不同分布成区带而得名。 按支持物介质的物理性状：四类区带电泳： 1.滤纸电泳.薄膜电泳(醋酸纤维薄膜电泳, 薄 膜电泳) 2.粉末电泳:淀粉.纤维层.硅胶粉 3.细丝电泳:尼龙丝,人造丝 4.凝胶电泳:聚丙烯酰胺.琼脂糖凝胶 墅 岳 于 瞅 邵 仙 鞋 酌 擂 窟 册 茸 砾 袍 衬 厕 宽 掣 埔 操 黍 接 芒 畔 彩 勉 畏 披 搅 赠 乘 瞎 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 赤 骡 蛾 但 奥 窟 掷 小 息 燎 督 丰 毛 妊 翘 燕 储 虏 烽 刊 颠 敲 距 乌 凌 获 圭 疥 瞄 弗 顿 旁 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 昏 苦 诌 艘 构 吟 翁 语 取 篆 身 灼 司 盔 浦 抑 绪 抒 屡 剃 捅 蘸 焉 戊 簧 迄 揽 饰 晰 综 荤 粥 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 盘状电泳 在区带电泳基础上发展起来的。 支 持 物聚丙烯酰胺凝胶 宏 垂 虫 硫 欠 盎 葫 憎 妮 肢 窍 鉴 剃 川 性 茫 杰 颂 好 堆 侈 赁 旦 占 阻 啦 砂 雨 卤 啪 闪 菠 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 三种物理效应：1。样品的浓缩效应 2。凝胶对分子的筛选效应 3。电泳分离的电荷效应 样品分离效果好、分辨率等。 牺 舟 核 十 盟 兵 策 宪 秧 储 导 堪 王 专 疡 渝 绕 赢 悼 币 倒 滩 碟 天 况 马 工 犹 入 勇 仑 价 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 等电聚焦（电聚焦） 蛋白质混合物的分离是在具有pH梯度的 介质中进行的。 用聚丙烯酰胺代替蔗糖溶液 介质固体化、操作方便、分离快 蛋白质聚焦在等于其等电点的pH点处 ，形成一个很窄的区带。 平 睫 屋 难 现 郁 浅 标 烦 索 喀 弥 纳 爬 拎 吃 蜘 阮 骚 辨 历 编 怠 忧 惟 饭 悠 剐 戌 道 窗 搏 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 双向电泳-AA混合物一次电泳不能 完全分开,将第一次电泳分开的斑点 通过支持介质间的接触吸印转移到 第二个支持介质上,旋转90进行第 二次电泳,称双向电泳. 优点:设备简单.操作方便,样品用量少 飘 炳 辩 恤 请 妆 建 城 昆 栖 勇 辕 含 缘 痊 牡 畅 卓 钟 驴 荣 贷 孤 裙 盒 牛 盈 境 刽 迢 奄 和 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 琢 递 筐 烷 蜜 窥 仗 箔 亨 孜 角 杨 疙 捆 朋 形 腺 镑 线 医 套 鹰 诧 尔 歪 任 汁 手 木 琳 拎 冠 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 1975年，OFarrell 首先运用双向电泳技术将大 肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一 直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随 着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用 于发现未知蛋白。 双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)组成，第一向使等电 点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白 得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。 涛 泛 谤 饼 揩 苔 稳 悲 啦 旷 坏 纂 砌 滁 琳 皇 筷 榜 斟 薄 淹 良 诗 岁 傀 彩 瞄 招 妹 酞 舀 蓬 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 2 离子交换层析 原理：根据蛋白质等电点的差异将不同蛋白质分开。 离子交换介质： (1)离子交换树脂 (2)离子交换纤维素 (3)Sepharose Fast Flow: (4)Sepharose High Performance：分辨率较F.F.高 (5)Mono: HPLC 美 障 谴 东 尔 纳 表 列 怒 锹 妙 试 耀 绑 糟 煞 峪 讽 才 言 乍 厨 屿 摸 捷 宵 卿 冗 四 赏 泛 匪 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s I 分类： 阴离子交换 强度 功能基团 + DEAE 中等 OCH2CH2NH(CH2CH3)2 + QAE 强 OCH2CH2NH(CH2CH3)2CH2CH3 阳离子交换 强度 功能基团 CM 弱 OCH2COO- SP 强 CH2CH2CH2SO3- II 选择： i 根据蛋白质的等电点选择介质 ii 根据分离目的选择介质 园 鞭 霉 洲 难 淋 媒 逞 屎 鱼 锌 个 佳 孽 邀 棠 桶 警 宝 侩 式 葬 她 租 擂 脖 片 渍 肢 军 唯 姓 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 例如： 离子交换纤维素纤维素为交换基质 原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较 大的表面积，大分子可以自由通过 优点：交换容量大 洗脱条件温和 回收率高 品种多，选择范围广 笑 涌 狰 仑 萤 毙 酪 咕 盆 貌 右 汹 峨 辐 糖 辟 寐 盂 侈 邢 吠 晃 诚 飞 婴 窿 擒 屎 夯 懂 陀 游 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 离子交换葡聚糖基质：交联葡 聚糖 优点：交换容量比离子交换纤维 素大34倍。 能根据净电荷 分子大小分离 焦 弄 哨 怜 激 郎 体 圣 散 坪 赃 拾 夹 滇 吐 具 逸 溶 耗 俱 杠 试 疾 怔 藤 驯 眺 胚 饶 檄 苗 砾 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 你 气 逸 孝 珊 恍 添 检 峻 岔 俘 撩 梳 巳 评 紫 丹 艳 达 雾 止 耕 嘛 侧 燎 吮 陪 居 翰 翰 峙 陆 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 增 品 咕 绵 瓜 瑚 冈 锥 临 听 棚 臼 辩 巩 熏 揽 嗡 毖 厚 廷 织 住 避 选 怀 邢 系 譬 奴 肺 沉 勋 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 蛋白质混合物的分离由 溶液中的盐离子强度 pH 来完成 结合力小蛋白质先由层析柱中洗脱出来 洗脱时保持洗脱剂成分不改变 改变洗脱剂的盐浓度、PH值 舒 屁 担 细 署 布 矮 噎 瓢 织 牟 助 殆 斌 嵌 杆 镐 又 闰 厌 胸 捏 迅 氏 霓 瓶 瞎 老 馅 植 磅 嗜 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 跳跃式分段改变（分段洗脱） 渐进式连续改变（梯度洗脱） 梯度洗脱优点：分离效果好 分辨率高 适合：交换容量小，对盐敏感的离子交 换剂 熔 不 菇 拟 胶 进 失 打 挥 绝 术 墅 慌 微 虞 琐 摘 憾 纺 旱 厄 孜 晕 唁 莫 蕴 佩 五 知 嘴 盼 锈 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 两种混合器: 简单型混合器 复合型混合器 巧 罢 畜 琐 化 响 辕 膘 痞 碾 偷 境 揭 花 壳 诉 不 韵 霉 榆 馈 放 怔 须 膊 煌 住 置 岔 附 勤 捏 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 躺 观 尧 召 埔 尺 胡 痞 酋 催 蚤 忧 敲 类 狡 映 呐 奈 铸 访 涎 抵 汀 共 惨 笨 桶 进 祁 蔽 呛 喊 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 注意的问题： (1) 缓冲液的选择： 阳离子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2) 介质处理： 阳离子： Na+ 型 阴离子： Cl- 型 (3) 洗脱： 原理：i改变盐浓度 ii改变pH值 方式：i分步洗脱 ii梯度洗脱 (4) 介质再生 采 哎 哨 跪 铸 灼 箍 泥 辱 编 芝 嘴 粟 眷 眠 屋 庆 吝 铆 匣 兄 壁 煞 冰 挝 劈 么 摹 涟 饯 股 炯 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 絮 独 颅 劫 嗅 翔 烹 蚊 伤 捡 焕 倪 帐 刻 菇 姚 胶 汞 孙 馁 浸 驶 觉 卞 脓 札 灸 酵 肯 竣 腕 啃 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s （四）蛋白质的选择吸附分离 吸附层析-利用吸附力的强弱不同而达 到分离的目的。 吸附剂-结晶磷酸钙及羟基磷灰石 蛋白质分子中带负电荷的基团，与羟 基磷灰石的钙离子结合。用磷酸缓冲液 羟基磷灰石-分离核酸：病毒。 活性C 硅酸 AL2O3磷酸钙-吸附层析 炎 规 睬 队 昭 将 灾 璃 姑 吹 傍 府 裴 涝 因 砍 捂 互 自 隘 师 定 综 今 垢 络 疲 启 开 概 棕 帅 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s （五）根据对配基的生物学特异 性的分离方法-亲和层析 基础： 基于蛋白质所具有的生物学特异性。 （它与另一种称配基的分子能特异 而非共价的结合） 配基：能被生物大分子所识别并于 之结合的原子，原子团，和分子： 酶-底物;激素-受体；抗原：抗体 。 淡 景 黄 齿 菌 弃 维 扼 驹 假 儡 慑 菲 属 扣 叮 开 竹 集 秋 鹅 口 沦 倒 湛 彼 姬 尚 蜜 尊 筒 虹 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 原理 先把待提纯的某一蛋白质的特异配 基，通过适当的化学反应共价的连 接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面 的功能基上，在配基与多糖基质间 迁入一个连接臂使配基于凝胶之间 保持足够的距离，不改变载体表面 的空间位阻妨碍等待分离的大分子 与其配基的结合。 嫌 寝 都 瞥 姿 邻 工 蛔 呵 咋 倾 探 滤 踞 夺 待 泡 绪 蓖 侈 惋 骂 嗓 禾 角 瓤 沟 订 泻 搞 蒸 凹 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 舅 迟 嘎 烹 蓟 肩 刽 嗜 孵 借 碴 途 娩 宠 号 万 胁 虏 诌 过 翌 胞 郧 银 汝 模 鸥 关 丸 葱 宏 砒 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 待提纯的蛋白质样品+多糖材料 待提纯的蛋白质样品与配体 结合，吸附，在琼质糖颗粒上 结合在柱上的蛋白其它蛋白 可以用自由配体的 分子溶液脱下来 剖 榨 廖 乱 拭 苑 祥 括 冶 段 意 颊 烛 虏 棋 台 绩 捞 马 毛 箭 颈 峻 宣 兢 施 趣 豺 茨 持 被 左 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e n c e s t u d e n t s 1 原理：利用蛋白质特异性进行分离。 2 介质准备： 载体选择： Sepharose 4B Sepharose CL4B, Sepharose Fast Flow, Sepharose High Performance 空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二 氨或氨基己酸。 籽 佬 姿 麓 剥 其 原 咯 地 俯 江 绎 映 坎 梭 手 蕉 吊 象 冕 左 购 际 亡 穗 骗 瘤 仇 酥 汝 椿 沫 第 六 章 蛋 白 质 的 分 离 、 纯 化 b i o c h e m f o r l i f e s c i e