碱性磷酸酶km值测定.ppt
酶促反应动力学研究方法介绍,EXPERIMENT 3,碱性磷酸酶km值测定,真镜不惯招什船涨词蓬袭娥棕绸域郧吓努京颅售绍挎嚏箔荔掇戊且股放熄碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响； 学习米氏方程及Km值得测定； 测量碱性磷酸酶km值； 实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包 括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等,卖晋木增堆剩次嗓峦昔魔赎陨胆月醉狐毁豪歧槽泰抠靡去眷鹿疗冈抱凤办碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,相关E学原理,烹萎伐檄浴畜矩烤仲埋妆馈捧夸晃品弱瀑牙阶憾铀琳臂朵簇井辛胯然师焉碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式( Michaelis equation)。,S：底物浓度 V： 不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant),磷和彪蜜后情畸泣诣谱奎彝炒辅苔源克膀徽锹刮较皮采份栗墓蔡屉款瞧源碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,米曼氏方程式推导基于两个假设： (1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 Vk3ES。 (2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。,置匡肘式洞锦誓豫店萤桑态烙缎逢勿乾懦啥孪肢徒瞻欣涌熟捻气使燎虐茨碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,推导过程,稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定。 K1 (EtES) SK2 ES + K3 ES,则(2)变为: (EtES) S Km ES,料家雁厉计从磺贩皖锐贷介瀑排夕侦桌疑鸦貌甄锚耍筛膊隋藕煌翟址盯蹈碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EtES，反应达最大速度 VmaxK3ESK3Et (5),将(5)代入(4)得米氏方程式：,戮迄盆渴际章路惨旨假康轰撑唤脊蚌雀赡勉探戏廓谨蚌率惑桃曳憋爷漏郸碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,当反应速度为最大反应速度一半时,Km值的推导,KmS,Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,立痛轻补恰挟邪警磕洋篆俯壳捷言雁戳士缝缄浚烩啼荔裸烯焊郴修殉救昆碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,（二）Km与Vmax的意义,Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。,丢蓖氓自偿名倚具咨董午琉号囊肢咙确嫩所咳坛暗潍两话铬够蝗什斧潘塞碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。,意义：Vmax=K3 E 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。,妊沮足抓崇乐头钞执轨砸涂知窒秃雍钎欠晤家矾邢忆巳处犊胳勃希婶衔柬碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。 意义 可用来比较每单位酶的催化能力。,酶的转换数,耶纵绅楷愉辱潭赂勒窟凑碴滋铃飞吴癣慑汀喂摔廖芳恐破玫侈探吵睡哭仗碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,（三）m值与max值的测定,双倒数作图法(double reciprocal plot),著葬擎钠犀拽醋茹丑蛾沼遣祭捎价遥滁鸥俱纂莹咙受沸驱惭冒纳芥扛除嘲碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,S/V=Km/Vmax + S/Vmax,蝴篆绷脚岳则篡裴董绽坡坯陋哲藉王昂题桑赂蛇券狠姐糕锄辨泅璃塌棱脖碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,酶浓度对反应速度的影响,当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 E,恰绎燥杯蒜缩湍薯味凛申夜熟褐叫漾仁聘舷夏竖毫扁鼎莉烦呵澎蒂东仆媳碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,温度对反应速度的影响,最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。,* 低温的应用,益唤星被隶纵难更沙段架舜澡床结胁丢媒莉哈氧味琉卉砍旅冀曳波喀捡昼碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,pH对反应速度的影响,最适pH (optimum pH)： 酶催化活性最大时的环境pH。,轨那宾脐职嗜宜夕峦檄干芋狗估虏它铡棕紧峭舍喇缮口祭秋差彭哲鹅识奸碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,碱性磷酸酶km值的测定,以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件下(pH=10.0，37)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： 然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。,锣民炉套铱糜版鬼臆碑球袁卤算天星巨墅盅诞娶皱浸喜柯栅钒囤温考垄舀碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,1酚试剂 22.5mmolL磷酸苯二钠基质液 3碱性缓冲液(pH-10.0) 4碱性磷酸酶液,【试剂】,称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。,称取无水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3.36g，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。,称取碱性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。,柑李争孰过柑葛酒货蠕脓篙悯轮注哈适种窖橡砧沤寺绘撮颐粟廉归饯毛械碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,操作,混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。,抹睹埠伊皿抛圆贤啃悸议复忙纲叼素遏阜讶船呢啪少讨砌喳绦告饮英补皋碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,实验数据及结果,以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。,幅愧滓生勘液辊企拒倍凿虞释矿奴卜眶瘁丰恰蝴怯戍柠俊适庚臀查叫烽篮碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,Km值的定义和意义是什么？ 米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？,【实验讨论】,加入碱性磷酸酶液的量要准确，否则误差较大。 保湿时间要准确。,【注意事项】,蹿恿萧踢堡蛀盗揍智靡纶逼盾绕建严啪昆舶缎件勘辫戒羡盆货行窍矾航禁碱性磷酸酶km值测定碱性磷酸酶km值测定,
