CRISPRCAS9慢病毒系统概述.pdf

CRISPR/CAS9慢病毒系统 吉凯基因 CRISPR/CAS9系统原理系统原理 CRISPR/CAS9系统： 基因组定点切割系统。 定点：sgRNA，碱基互补配对 切割：CAS9蛋白，核酸内切酶 无模板 随机修复（NHEJ） 读码框移位 蛋白无表达 Knock out 有模板 重组修复(HDR) 精确插入碱基 Knock in CRISPR/CAS9系统原理系统原理 Gene knock out Gene knock in CRISPR/CAS9 VSRNAi-敲除效果敲除效果 lentiCRISPRs abolished EGFP fluorescence in 938% of cells after 11 days. 参考文献：参考文献：Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. CRISPR/CAS9 VSRNAi-靶点一致靶点一致 参考文献：参考文献：Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. 靶点间一致的概率： CRISPR/CAS9：7827% shRNA：2012% CRISPR/CAS9 VSRNAi-表型呈现表型呈现 RNAi 敲减敲减OK 无表型无表型CRISPR/CAS9 表型明显表型明显 参考文献：参考文献：Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. CRISPR/CAS9 VSRNAi 对比RNAiCAS9 作用水平mRNA水平基因组水平 靶位点范围仅转录本 所有基因组序列，如外显子，内含 子，启动子，增强子，基因间序列等 靶蛋白消除水平不完全消除完全消除 靶蛋白功能部分丧失完全丧失 消除后具功能靶基因表型呈现不一定呈现肯定呈现 针对同一基因多靶点表型一致率2012%7827% 参考文献：参考文献：Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. 与RNAi相比，CRISPR/CAS9在基因功能学研究中具有独到优势： CRISPR/CAS9系统系统载体载体 质粒质粒慢病毒慢病毒腺病毒腺病毒 构建时间构建时间7 days，快25 days，较快较快45 days，慢 使用范围使用范围少数易转细胞，窄大多数细胞，宽宽大多数细胞，宽宽 导入效率导入效率少数较高多数高多数高多数高多数高 细胞分裂表达水平细胞分裂表达水平减弱，直至丢失稳定表达稳定表达减弱，直至丢失 对细胞状态影响对细胞状态影响较大小小较大 持续表达时间持续表达时间短长，可永久表达长，可永久表达较长，终会丢失 功能学研究适用度功能学研究适用度局限适用适用细胞状态影响大 慢病毒载体在基因功能学研究中具有独到优势： 新高大上：新高大上：CRISPR/CAS9与慢病毒与慢病毒 Paper 1:High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. IF：42Journal: Naturedate：2014 May Paper 2: Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. IF：39.08Journal：Nat Biotechnoldate：2014 Mar Paper 3: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9genome editing. IF：39.08Journal： Nat Biotechnoldate：2014 Jun Paper 4: Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. IF：26Journal： Nat Methodsdate：2014 Jul 方式一：方式一：双双慢病毒载体介导的慢病毒载体介导的CRISPR/CAS9 Paper 1:High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. IF：42Journal: Naturedate：2014 May CAS9稳定表达细胞株CAS9表达慢病毒 sgRNA表达慢病毒 EGFP绿色荧光筛选 细胞出现表型 感染稳定细胞株 基因功能确定 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 切割： Lenti-CAS9-puro 表达CAS9蛋白+puromycin筛选 定位：Lenti-sgRNA-EGFP/RFP/G418 表达sgRNA+EGFP荧光标记 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 切割： Lenti-CAS9-puro 滴度可达2E+8 已成功构建两株CAS9稳定表达细胞株 定位：Lenti-sgRNA-EGFP 滴度可达3E+8以上 可成功引入突变 ctl nc C1 C2 Cas9 nc G1 nc G2nc G3 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 -wt 缺失 23bp 增加 10bp CAS9双载体慢病毒系统可成功对靶位点造成修饰 缺失 37bp 增加 1bp -wt 例1： 例2： 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 吉凯所设计sgRNA具有高阳性率。 吉凯吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍双载体慢病毒系统介绍 吉凯所设计sgRNA具有高阳性率。 方式二：方式二：单单慢病毒慢病毒载体介导的载体介导的CRISPR/CAS9 Paper 5: Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. IF：31Journal: Sciencedate：2014 Jan 感染一个病毒，同时表达CAS9蛋白和sgRNA 吉凯吉凯CRISPR/CAS9单载体单载体慢病毒系统介绍慢病毒系统介绍 定位：定位： sgRNA 切割：切割：CAS9 标记：标记：Puromycine/EGFP 吉凯吉凯CRISPR/CAS9单载体单载体慢病毒系统介绍慢病毒系统介绍 CAS9 蛋白表达 可对靶位点有效切割 可成功引入突变 ctl nc C1 1 2 nc Cas9 CRISPR/CAS9慢病毒系统应用 Gene功能研究： 针对敲减无功能基因 感染后细胞进行相关功能研究，并多靶点验证 CRISPR/CAS9 HCS高内涵筛选系统 文库：（敬请期待） Human sgRNA Library Mouse sgRNA Library 与深度测序联用，功能相关靶基因筛选 境况境况1：基因：基因RNAi后后无表型无表型? 换用换用CRISPR/CAS9慢病毒试试慢病毒试试! Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. RNAi 敲减敲减OK 无表型无表型CRISPR/CAS9 表型明显表型明显 境况境况2：基因组突变疾病相关研究？：基因组突变疾病相关研究？ RNAi间接甚至不可用！慢病毒间接甚至不可用！慢病毒介导介导的的CRISP/CAS9技术！技术！ Paper 1: MLL3 is haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia. IF：24Journal: cancer celldate：2014 May MDS（骨髓发育不良症候群）和（骨髓发育不良症候群）和AML（急性髓细胞样白血病）常见（急性髓细胞样白血病）常见染色体染色体7q部分部分 缺失。缺失。通过通过CRISPR/CAS9技术验证其上技术验证其上MLL3基因是发挥作用基因。基因是发挥作用基因。 Paper 2: Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. IF：39.08Journal： Nat Biotechnoldate：2014 Jun 恶性肿瘤往往存在恶性肿瘤往往存在多处基因组突变。多处基因组突变。通过慢病毒介导的通过慢病毒介导的CRISPR/CAS9技术对小鼠技术对小鼠 hematopoietic stem cell (HSC）5个基因进行修饰，导致恶性肿瘤个基因进行修饰，导致恶性肿瘤AML。 境况境况3：RNAi有有功能！功能！ CRISPR/CAS9锦上添花！锦上添花！ Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):652-65. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.016. Epub 2014 May 1. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia RNAi证明：证明： CRISPR/CAS9验证：验证： 境况境况4：老老树开新花！树开新花！ CRISPR/CAS9老基因研究！老基因研究！ J Orthop Res. 2014 Oct 27. doi: 10.1002/jor.22745. Targeting Cdk11 in osteosarcoma cells using the CRISPR-cas9 system. 增殖 转移 侵袭 检测原理检测原理