吞噬细胞吞噬功能的检测.doc

吞噬细胞吞噬功能的检测 一、小吞噬细胞的吞噬作用 (一) 体内法材料 (1) 动物: 豚鼠。 (2) 菌种: 金黄色葡萄球菌菌液。 (3) 无菌注射器及针头、无菌肉汤、玻片、瑞氏染液。方法 (1) 第1天注射无菌肉汤10 ml 于豚鼠腹腔，隔24 h 同法注射肉汤5 ml。20 min 后，再注射金黄色葡萄球菌菌液Iml 于上述部位。 (2) 注射完毕，每隔20 min 用注射器抽取腹腔液，并做推片，待其自千后，用瑞氏染色法染色，镜检时见金黄色葡萄球菌被小吞噬细胞吞入胞浆时为宜。 (3) 瑞氏染色方法如下: 将瑞氏染液滴加数滴于涂片上。加入等量的蒸馏水，轻轻混匀，染5 -10 min。用蒸馏水(或自来水) 冲洗。待干或轻轻用吸水纸将涂片吸干，油镜检查。 结果 染色后，可见小吞噬细胞的核及被吞噬的细菌呈深紫蓝色，而小吞噬细胞的胞浆为紫色。(二) 体外法 目的 1.熟悉检测白细胞吞噬作用的原理与实验方法。 2.通过吞噬细胞的吞噬功能检测了解机体的非特异性免疫功能。3.掌握显微镜、油浸镜的使用与保护方法。原理 中性粒细胞具有在噬杀菌功能，当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合后，孵育一定时间，颗粒物质被中性粒细胞吞噬。根据吞噬率和吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能，但不能反映其杀伤功能。 材料 (1) 3.8% 枸橼酸钠。 (2) 碘伏、无菌注射器及针头、吸管、试管、载玻片、温箱等。(3)瑞氏染液(4) 葡萄球菌悬液: 取白色葡萄球菌在琼脂斜面上生长24 h的培养物，用无菌生理盐水刮洗下菌苔，用PBS洗涤2次，最后用比浊法将菌液调整至5 x10 7ml 悬液，100加热15min，置4冰箱备用。 方法(1) 自静脉采血0.2 m,放于含3.8% 枸橼酸钠0.2 ml的小试管中，混匀，防止凝血(或由一人抽血10 ml 抗凝，供全小班使用)。(2) 取葡萄球菌悬液0.2 ml,加于上述血液中混匀。(3) 37 C温箱孵育30min,每10 min取出振摇1次，再继续静置孵育，于30 min 时取出。(4) 用毛细管从白细胞层(即沉淀红细胞的表层) 吸取白细胞1滴，滴在载玻片上，推成薄片，自然干燥。注意: 推制厚薄适宜的血膜片，血膜应呈舌状，头、体、尾清晰可分; 推制好的血膜应在空气中晃动，以促进快干; 天气寒冷或潮湿时，应于37 C温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。(5) 瑞氏染液染色可用30 s快速单一染色法: 将染液铺满血膜，30 s以后用自来水冲洗。切勿先将染液倾去再冲洗，以免染液中的细小颗粒附着于玻片上使标本观察不清晰。(6) 干燥后油镜检查，寻找白细胞，计数。 注意应选择涂片的体尾交界处染色良好的区域进行计数，由血膜边缘向中央依次上、下呈曲线运动，以免重复计数(图2-2)。 结果染色正确时，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞的细胞浆则染成红色。计数200 个中性粒细胞，记下吞噬细菌的细胞数，以及每个中性粒细胞吞入的细菌数，分别求出吞噬百分率以及吞噬指数。其计算公式为: 200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数吞噬率(%)= 100%200 200个中性粒细胞吞噬细菌的总数吞噬指数(%)= 100%200二、大吞噬细胞的吞噬作用 材料(1)动物: 豚鼠。(2) 10%鸡红细胞悬液、2% 无菌可溶性淀粉溶液。(3)无菌注射器及针头、玻片、瑞氏染液。 方法(1) 注射2% 可溶性淀粉液10 m于豚鼠腹腔内。(2) 次日重复腹腔注入2%可溶性淀粉溶液5 ml，1h后再腹腔注人10% 鸡红细胞悬液3ml。(3) 鸡红细胞悬液注入后，每隔20mn用空注射器抽取豚鼠腹腔液至1h，并做推片，待其自干（或用甲醇固定了3min，水洗），用瑞氏染色法染色(其方法同前)，镜检见鸡红细胞被大吞噬细胞吞噬入胞浆内为宜。 思考题影响吞噬细胞吞噬的实验因素有哪些?