烟草瞬时转化.doc

.本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、 农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、 实验步骤：1、 根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。2、 将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28，200rpm过夜。*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。3、当菌液OD值介于0.61.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。4、用2ml Induction medium（without AS） 轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。5、重复步骤4。6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。7、室温放置14小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。9、 用不加针头的注射器将侵染液注射进68周大的本氏烟草叶片中。*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂：Induction medium：MES-KOH PH 5.7 10nMMgCl2 10mM AS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4保存，用时稀释100倍。1M MgCl2 过滤灭菌，4保存，用时稀释100倍。0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20。用高压灭菌的超纯水稀释。C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。D、关于侵染液浓度：精品.推荐每个菌株的浓度在0.10.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！精品