DNA的粗提取与鉴定(修改版).ppt

DNA的粗提取与鉴定,目的要求 知道DNA提取原理 据原理设计DNA提取方法 能对DNA进行鉴定 掌握本实验的基本操作方法,一、实验原理,1.血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。,2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。DNA在物质的量浓度为0.14 molL的氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。,3.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,5.注意事项：最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,实验材料和用具,实验材料： 1、新鲜鸡血细胞液（510ml）； 2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）； 3、蒸馏水； 4、质量浓度为0g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂） ； 5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液； 6、二苯胺试剂。,实验用具： 铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,二、方法与过程,1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA。,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。,两层纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。,原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水涨破，玻璃棒快速搅拌，机械加速血细胞破裂。,.提取血细胞核物质：,.溶解核内的DNA：,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。,不要碰底！,用吸管吸走上清液,抗凝剂,DNA含量高,防止DNA破碎,防止DNA破碎,溶解DNA效果好,取滤液,涨破,.析出含DNA的粘稠物：,.滤取含DNA的粘稠物：,. DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现白色丝状物；当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。,用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中一个方向轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.过滤含有DNA的NaCl溶液：,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液，滤液中含有DNA。,取滤渣（析出物）,取滤液,含杂质的DNA,.提取含有杂质较少的DNA：,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中析出乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA的鉴定：,加入0.015mol/L的NaCl溶液5mL和二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水浴5min，待冷却后观察溶液是否出现蓝色。,1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”,2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”,三、实验小结,析出DNA效果好,DNA细小易碎,反应条件,溶解DNA,防止血凝固,使血细胞涨破,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得 DNA最大限度地析出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,析出DNA, A出现蓝色 B无变化,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是( )。 A.稀释血液、冲洗样品 B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,反馈练习,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ ） A .防止凝血 B. 加快DNA析出 C .加快DNA溶解 D.加速凝血,练一练,A,2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（ ） A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l 3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ） A 加快DNA溶解的速度 B 加快溶解杂质的速度 C 减小DNA的溶解度，加快DNA析出 D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,C,C,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是 A 减小;减小 B 增大;增大 C 先减小后增大 D增大; 减小 5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是 A 加蒸馏水 B 加矿泉水 C 加清水 D 加生理盐水,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整 C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度 D 当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴） A 硅红色 B 红色 C 紫色 D 蓝色,D,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA的释放。,DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之涨破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。,2.DNA与蛋白质分离。,在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，释放出的DNA也溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA的析出与获取。,因为DNA在低浓度（ 0.14mol/L ）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。,4.DNA的再溶解。,用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。,5.DNA的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na的DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA的鉴定。,鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。,