发酵过程中工艺参数控制及检测.ppt

第七章 发酵过程中工艺参数的 检测和控制,发酵涉及到微生物学、生物化学及发酵工艺学知识。要想获得高产，对生产菌的生活规律要充分了解。除了生产经验外，还需要科学的检测手段。,第一节 工业发酵的重要类型 第二节 发酵过程的主要控制参数 第三节 菌体及基质浓度对发酵的 影响及控制 第四节 溶氧的浓度对发酵的影响及控制 第五节 pH对发酵的影响及控制,第七章 发酵工艺控制,第六节 温度对发酵的影响及控制 第七节 二氧化碳对发酵的影响及控制 第八节 补料及泡沫对发酵的影响及控制 第九节 工业发酵染菌的防治 第十节 发酵终点的判断,第一节 工业发酵的主要类型,一、按投料方式分 微生物培养有三种方式，分批、连续培养和分批补料。 二、按菌体生长与产物形成关系分 微生物发酵过程中的动力学类型 类型I、类型II、类型III,第一节 工业发酵的主要类型, 分批发酵法(batch fermentation) 分批发酵又称分批培养，发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。,第一节 工业发酵的主要类型,（二） 连续发酵法(continuous fermentation)在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中的菌体进行连续生长和发酵。,Flash1,第一节 工业发酵的主要类型,（三） 补料分批发酵法(fed-batch fermentation)补料分批发酵又称半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。,第一节 工业发酵的主要类型,二、按菌体生长与产物形成关系分 微生物发酵过程中的动力学类型 类型I、类型II、类型III,微生物发酵过程中的动力学类型,比速率：是1克细胞每小时形成产物的克数或每克细胞每小时利用糖的克数（g/g.h）或每克细胞每小时繁殖细胞的克数。,类型I：菌体的生长、碳源的利用与产物形成的比速率曲线均有一个高峰，且高峰基本上在相同的时间出现。如单细胞蛋白生产等。,类型II：可粗略的分为两个节段，在发酵的第一期菌体迅速生长，产物形成很少或全无，在第二个阶段产物高速形成，菌体生长和糖耗也相应增加。如柠檬酸和某些氨基酸发酵。,类型III：生长和产物是来自两个代谢途径，而不是来自分解代谢途径，在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成产物，也就是，初级代谢和产物形成是完全分开的，如许多抗生素发酵。,Flash2,第二节、 发酵过程的主要控制参数,工厂设备越先进，产品附加值越高，检测的参数就越多。但工厂生产讲究越简单越好。发酵控制一般分为物理、化学、生物三类。 一、物理参数 1 温度：最适生长温度，它与酶反应速率，氧的溶解、产物合成都有关。如四环素生产菌在30时合成金霉素，35时，只产生四环素，合成方向会改变。生长温度与合成温度不同。如青霉素，生长30，合成24.7。,2 压力（Pa，帕斯卡）。 98070Pa=1Kg/cm2 1Mpa 103Kpa =106Pa。 灭菌压力 1Kg/cm2=0.11Mpa。 发酵罐压一般为 0.020.05Mpa。,3搅拌转速（r/min）。 罐体积 转速（r/min） 通风量（m3/m3. min ） 50L 550 1：0.6 50000L 110 1：0.12 一般来说，假如小罐与大罐的几何相同。但为什么转速会相差这么大？原因大罐气液接触时间长，氧的溶解率高，搅拌和通气均可小些，,一、物理参数,4搅拌功率（KW） P/V KW/m3 生产上：一般用瓦特计直接测量电动机的耗用功率，从中减去各项传动摩擦所损耗的功率。对小罐，误差较大。用电阻应变式动力计测量。,一、物理参数,5 通气量（V/V.min） 气体流量用转子流量计测量。用m3/m3. min，指每分钟每立方米发酵液通进1立方米空气，用11表示。 如柠檬酸10.15，而青霉素11。,6粘度 Pas(秒） Pa= 1N/m2 是细胞生长和细胞形态的一项标志，它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体的浓度。,7浊度：反映单细胞生长状况的参数。如大肠杆菌，用光密度650nm上检测或计数板计数。,8料液流量（L/min） 这是控制流体进料的参数。,二、化学参数,1 PH：发酵过程中产酸或产碱的生化反应的综合结果。细菌是多少？酵母、霉菌、放线菌？,二、化学参数,2 基质浓度：指营养成分的浓度，发酵过程中必须定时测定还原糖，总糖，磷酸盐、氮（氨基酸或氨氮）等基质的浓度。,二、化学参数,3 溶解氧浓度：mmol/L, mg/L, ppm或用% （指饱和浓度的百分数）表示。利用它的变化可了解生产菌对氧利用的规律也能反映发酵的异常情况。科研上用于检测设备供氧能力的指标。,二、化学参数,5 产物的浓度：ug/ml，生产中合成期产物的浓度需要测定，如柠檬酸生产用NaOH滴定，抗生素用抑菌圈大小测定。,二、化学参数,6 废气中氧和二氧化碳的浓度：用顺磁氧分析仪测定氧气的浓度，用红外二氧化碳分析仪测定二氧化碳浓度，如氧气减少和二氧化碳增加表明是好氧代谢的结果。,三、生物参数,1.菌丝形态：观察菌丝形态是生产 中最常用的方法。每隔8小时镜检， 能及时发现异常染菌。如青霉素生 产，生产菌生长分为I.孢子发芽， II.菌丝增殖，III.菌丝分枝旺盛， 出现脂肪颗粒，IV.菌丝生长减缓， 细胞内出现小气泡，V.气泡增大， 颗粒消失，产物形成，VI.气泡延伸 ，菌丝自溶。,2. 菌体浓度：测定方法有三种： A.湿重法：量100ml发酵液，进行过滤，滤后菌体用水洗净，然后用吸水纸将水分挤干，直接称量。,B.干重法：上述步骤菌丝放85烘干至恒重。,C.体积法：取样品10ml放于刻度离心管内，用转速为3000转/分离10min，计算%（V/V）。固体原料也在其中，但如培养基组成不变条件下，具有相对准确性。,第三节 菌体及基质浓度对发酵的影响及控制 3.1 菌体浓度 对初级产品来说，菌浓愈大，产量愈高，但菌浓符合生长曲线。象柠檬酸生产由糖转化成酸。 次级产品如菌浓过大，由于代谢产物的积累，会影响产量。因其产品与原料并非对应（或底物抑制，分介产物抑制等）。,C源，青霉素生产中葡萄糖和乳糖利用。因此工业上培养基中含有迅速和缓慢利用的混合C源。如为聚合物，利用缓慢。,3.2 基质浓度,N源，也有迅速利用和缓慢利用，前者有氨基酸、硫酸铵、尿素和玉米浆，后者有黄豆饼粉、花生、棉子饼粉等蛋白质。前者菌生长快，但产量低，选用快、慢混合氮源很重要。生产上可补加有机或无机氮源。,3.2 基质浓度,磷酸盐：P是核酸，许多辅酶，ATP，组成部分，P对微生物生长、代谢有重要作用。 工业多以供应KH2PO4、K2HPO4为磷源，配料时， KH2PO4计算，每克KH2PO4理论磷含量227毫克，如将其溶在1L水中，就是227ppm。用链霉菌生产四环素时，菌体生长最适磷为65-70ppm，合成为25-30ppm。,测定方法：磷与钼酸铵（NH4）2M0O4作用，生成磷钼酸铵，在酸性条件下，用VC还原，生成钼蓝，然后比色。,3.3基质浓度的控制,分批补料培养（fed-batch culture,简称FBC），是指在分批培养过程中，间歇和连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。有报道四环素发酵不补料的话，培养72-96h，发酵单位5500-7000单位/mL，而补糖的批号，发酵周期延长到120-130h，单位提高到10000-12000u/ml。,避免一次投料，菌丝生长过盛。 延长次级代谢产物的分泌期，提高产量。,中间补料的机理,FBC的内容,补碳源、氮源（无机和有机），如蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、尿素。 无机盐，微量元素，前体和促进剂。 补全料和补水，总之视情况不同，补单项还是全部。,补料的时间和方式,补料的时间很重要，有人研究加糖时间对四环素发酵单位的影响。 接种 20h 45h 62h 产量 6000 u/ml 10000 u/ml 5000 u/ml 一般认为，过早补糖，可能刺激菌丝生成，加速糖的利用，过迟补糖，可能菌丝的内在质量已受到一定损害，补糖只是干扰代谢并不能提高产量。,补料的时间和方式,补料的方式： 小量间隙多次补入。 小量连续滴加补入。 大量多次补入或大量少次补入等。,补料的实例: 如庆大霉素生产，大罐总体积20吨，第一次装料7吨，接种后15h一次性补5吨，然后在30-60h中小量间隙多次补入6吨料（全料），视生长情况决定是否在80h补适量水。总周期120-130h。,一、溶氧的浓度对发酵的影响,微生物对氧的需求： 1、 C6H12O6+6O26CO2+6H2O+能量 从分子式看出，180g葡萄糖完全氧化需190克O2。 2、构成细胞成分含有氧，如酵母细胞元素组成为C3.95 N6.5 O1.94。,第四节 溶氧的浓度对发酵的影响及控制,O2在水中的溶解度很低。如在25，1个大气压下O2溶解在水中的量为0.2mmol/L，或6.4mg/L。而微生物需氧量2050mmol/L.h，正常情况下，只能维持2050秒钟,水中氧消耗完。 怎么供氧呢？用纯O2输入发酵罐，效果好，但O2在水中的溶解度较低，大多跑了，成本高，没有实用价值。,返回,基本概念： 1、微生物摄氧率（ ）mmol O2/（L） 单位体积培养液每小时消耗的氧量。 、呼吸强度（o2） mmol o2/g（干菌体）.h 单位重量的干菌体每小时消耗的氧量。 两者关系 =Qo2.X X 发酵液中菌体密度（ g/L）。,临界氧浓度,3.临界氧浓度： 微生物对发酵液中溶解氧浓度有一个 最低要求，这个浓度叫临界氧浓度。,临界氧浓度,不同微生物C临界不同，见下表： 菌种 温度. C临界（mg/L） 大肠杆菌 37.8 0.26 酵母菌 34.8 0.15 产黄青霉 24 0.7 表明青霉菌摄氧率高，发酵时空气通气量大。,同一种菌生长不同阶段C临界不同。如幼龄菌大于老龄菌 另外一般生产菌都是： 生长期大于合成期的临界氧浓度。,二、氧在液体中的溶解特性,饱和浓度：气体与液体相接触，气体分子就会溶解于液体之中。经过一段时间的接触，气体分子在气液两相中的浓度就会达到动态平衡。 溶解氧的饱和浓度（ C* ）的单位可用mmol o2/L 、ppm、和mg o2/L。 影响氧饱和浓度的主要因素有：,二、氧在液体中的溶解特性,（一）温度：工业产品大多是随着温度升高，溶解度增加，；利用这个特点得到晶体。如柠檬酸、葡萄糖等。而O2正相反，温度增加，C降低。 温度（） 0 35 溶解度 （mmol o2/L ） 2.18 1.09 （纯氧）,（二）溶液的性质：氧在不同性质的溶液中的溶解度是不同的。 同一种溶液由于其中溶质含量不同，氧的溶解度也不同。 盐酸 0.5 mol 1 mol 2mol 1.21 1.16 1.12 溶质含量越高，氧的溶解度就越小。,氧在液体中的溶解特性,（三）氧分压； 亨利公式：C*=H-1Po2 C*在平衡状态下液体中氧的溶解度（m mol o2/L） Po2氧分压 MPa H亨利常数MPaL/ mmol o2 从公式中可知C*与Po2成正比。气相中氧的浓度取决大气压和纯氧；罐压提高，Po2提高。C*增大，但不能太高，纯氧也可提高。利用吸氮装置，减少空气中的氮气，增加氧含量。,理论上，发酵过程中： 温度越低，C*越高， 溶质越稀，C*越高， 罐压越高，C*越大。 但工业上应用都受到限制。,三、 氧在溶液中的传递,N= KLa （C*CL) 式中 N氧的传递速率， mmol O2 /h； C* 溶液中饱和溶氧浓度，mmol O2 L； CL溶液主流中的溶氧浓度， mmol O2 L； KLa以浓度差为推动力的氧传质系数， 1h； a比表面积（单位体积溶液中所含有的气液接触面积m2m3 ）。因为a很难测定，所以将 L当成一项，称为液相体积氧传递系数， 1h,四、氧的传递方程式,N= KLa（C*CL) 双膜理论： 是气体吸收的基本理论： P空气中的分压； Pi界面处氧分压； PPi 称为推动力（气相） Ci界面处氧的浓度；CL液相中氧的浓度； CiCL 为液相推动力。,在稳定传质过程中通过双膜的传氧速率N应相等。 N=KGa（PPi）= KLa（CiCL） 由于Pi和Ci无法测量，因此改为 N=KGa（PP*）= KLa（ C*CL） N= KLa（C*CL),五、影响供氧的因素,氧的传递速率 N= KLa（C*-CL） 影响氧传递推动力的因素：C*-CL 1提高C*，因素有温度、溶液、氧分压，三点都有局限性。在抗生素生产中有时需要补水，原理使溶液稀释，C*提高。 2降低发酵液中的CL 如降低通气量和搅拌速度可降低CL，但发酵过程中发酵液的CL不能低于C临界，否则就会影响微生物的呼吸。,影响 KLa的因素 经过长时间的研究和生产实践证实，影响发酵设备的 KLa 。主要因素有搅拌效率、空气流速、发酵液的物理化学性质、泡沫状态、空气分布器形状和发酵罐的结构等。,（一）搅拌功率对 KLa的影响,（1）搅拌的作用 A.把大气泡打碎，增加气液两相的接触面积， KLa增加； B.降低液膜厚度， KLa增加； C.减少菌丝结团，减少菌周围液膜阻力，并有利于排出废气；,啤酒酵母培养,搅拌速度(rmin) KLa 摄氧率 300 40 576 500 169 720 700 216 864,（二）空气流速,KLa与空气流速（ V）有关。 V增加 KLa增加。但当V增加到一定值后 KLa便不增加，因存在所谓气泛现象，即空气流速过大时，气流形成大气泡在轴的周围逸出。,螺旋桨式搅拌器 圆盘平直叶涡轮搅拌器,（三）发酵液理化性质的影响。,KLa与粘度成反比。在发酵过程中，由于粘度变化，而使发酵液呈多种流变学性质（液体的湍动性和液膜的阻力）。 一般细菌、酵母发酵液粘度为一常数。 放线菌、霉菌粘度不是一个常数。,复膜氧电极的原理 溶氧电极可以看作是一种电解电池，它有两只具有不同电性的电极，一只是银丝做成的阴极，另一只是铅皮卷成的阳极。这对电极装置在两端开口的细的玻璃套管内，在靠近阴极的一端用一种耐热的、只允许气体透过而不透过水及离子的半渗透塑料膜覆盖，形成一个有一定容积的电池，在电池中加入数毫升的电解质溶液（5mol HAC0.5mol NaAC十0.1mol PbAC2）。这就在两极之间产生了一个电位，使阳极的铅变成铅离子Pb+进入电解质溶液，同时放出的电子在阴极上把透过半透膜进入电池的氧立即还原成OH（见图）,六、液相中氧的浓度的测定,阳极的反应： Pb Pb+ +2e 阴极的反应： 2e+1/2O2+H2O2 OH-,复膜氧电极操作：在实罐灭菌时将电极装入，灭菌后电流表指示为最低值，这时通气保压、搅拌、降温，溶氧CL会达到最大值，电流表指示为100%。一般在抗生素生产时，接种后11个小时电流值保持一定，12小时后开始下降，43小时为最低值，随后电流值便上升。,7.2 发酵过程中溶氧的变化。,培养基灭菌后，通入无菌空气，降温后培养基中的溶解氧达到 ，一般发酵前期随着微生物摄氧率（）的不断上升，溶氧量出现一个 。经过一段时间平稳期后，便随之 。,返回,7.3 溶氧的控制,菌的生长所需要的氧应略高于临界值。 控制溶氧浓度的方法有: 1.搅拌转速 2.进气量 3.适当降温、补水和加泡敌来改善溶氧水平。,第五节、pH对发酵的影响及其控制,5.1 pH值对菌生长和代谢产物形成的影响。 不同菌生长pH值不同 改变发酵方向 黑曲霉pH2-3时产柠檬酸，pH7时生成草酸。 生长和合成pH不同 如链霉素产生菌生长的最适pH为6.3-6.9，而合成pH6.7-7.3。,改变菌膜电荷。 直接影响酶的活性。 影响培养基中营养物质和中间代谢产物的介离。 该物质都在水中解离，氢离子浓度对这些物质 的解离影响很大，从而影响微生物的营养吸收、 酶的活性等。,pH影响菌生长的机理？,（1）调节 发酵过程中由于营养物质的分解，菌的代谢等，pH值会发生变化。调节的方法有： H2SO4和NaOH直接控制 用补硫酸铵和氨水控制 PH较高时补加硫酸铵。当pH较低时补加氨水。 可以通过补加糖或油来调节pH,（2）控制 最适pH在微生物生长和产物形成的关系中有四种情况。比生长速率（u）和产物比生产 速率（Qp）最适pH范围较宽， 生产较易控制。 u、Qp二者一个较宽，一个 较窄。 二者都较窄，pH又相同。 二者都较窄，pH又不同。,在发酵过程中，产热的因素有生物热(Q生物)和搅拌热(Q搅拌)；散热因素有蒸发热(Q蒸发)、辐射热(Q辐射)。产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热Q发酵，kJ(m3 .h)， 即Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射。,第六节 温度对发酵的影响与控制,第六节 温度对发酵的影响与控制,6.1 发酵热 发酵过程中产生的热能减去散失的热能，所得的净热量就是发酵热。 生物热（Q生物） C6H12O6+12O66CO+6H2O+热量，除了用于合成外，其余部分则以热的形式散发出来。对数生长期产热量多。热量的单位（ KJ/ m3 .h),第六节 温度对发酵的影响与控制,搅拌热（Q搅拌） 液体与搅拌设备之间的摩擦产生的热量。 Q搅拌=P/V3600。 （KW/m3KJ/Kw.h） 3600为热功当量。,蒸发热（Q蒸发） 通气时，引起发酵液水分的蒸发被冷空气和蒸发水分带走的热量叫蒸发热。,辐射热（Q辐射） 因发酵液温度与罐外温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。 由于Q生物及Q蒸发在发酵过程中是随着时间变化的，因此发酵热在整个过程中也随时间变化，发酵罐操作也需要降温、加温控制。,通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，用下式计算： Q发酵=G.c（t1-t2）/ V 单位 千卡/m3.h G冷却水 c水的比热 t1、t2 进出的冷却水温度（）。 V发酵液体积（m3） 一般抗生素发酵过程中的最大发酵热均为3000-5000千卡/立方米.小时。,6.2 发酵热的测定及计算,抗生素生产，菌的生长和合成需不同温度。有人试验青霉素变温发酵，起初5小时，维持在30，以后降到25培养35h，再降到20培养85h，最后又提高到25，培养40小时，放罐。青霉素产量比在25恒温培养提高14.7%。因此生长的温度和合成的温度并不一致。,6.3 控制温度的应用,CO2的来源和影响 CO2浓度高对微生物生长不利。 1. 当细胞膜的脂质相中的CO2浓度偏高，细胞膜运输受到阻碍，生长受到抑制 2. 使发酵液pH降低，影响菌生长和产物合成。,第七节 CO2的影响及其控制,但某些菌又需要适量的CO2 。栽培金针菇菌最明显。动物细胞培养需要CO2培养箱 。 CO2能合成某些小分子前体物质如: 丙酮酸+CO2+ATP草酰乙酸+ADP+Pi。 再如脂肪酸生物合成也需，如乙酰CoA+CO2 丙二酰CoA长链脂肪酸。,8.1 泡沫的性质：泡沫是气体分散在液体中的一种胶体系统，气泡间被一层液膜隔开而彼此不相连通。 8.2泡沫的危害： 造成大量的逃液，而使装料系数减少。 泡沫从轴封中渗出，增加染菌机会。 妨碍菌的呼吸和生长，使产量下降。,第八节、泡沫的影响及其控制,8.3 泡沫产生的因素： 与高速搅拌及大空气流量有关，发酵时前期要注意空气流量，先小后逐步加大 培养基成份有关：蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉等，高蛋白，易起泡。 菌种不同，如有的生长慢，易起泡。,8.4 泡沫的消除： 机械消沫：在罐内装消沫浆。但作用不大。 化学消沫： A.消泡剂有天然油，豆油，菜子油等，它还作为碳源被菌利用。 B.高分子物质如聚氧乙烯氧丙烯甘油，（GPE）又叫泡敌。消泡能力比植物油60-80倍强。目前工业上已取代油。,8.5消泡的原理： .泡沫表面层存在着极性的表面活性物质，而形成双电层时，可加入另一种有相反电荷的表面活性剂，可降低其机械强度，促使其破裂。 .泡沫表面粘度较大时，可加入某些分子内聚力较小的物质，以降低其表面粘度而使其破裂。,（一）减少泡沫形成的机会。 原料配比。补料：如基础料被抽出一部分蛋白质原料，在菌丝长浓后再加入。灭菌前加. （二）消除已形成的泡沫。 起泡时加。加量一般为培养基总体积的0.02%-0.002%。多加对菌生长不利。,8.6控制泡沫的方法,第九节发酵生产染菌及其防治,所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而造成生产损失。 据报道，国内的青霉素发酵染菌率2，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5，谷氨酸发酵噬菌体感染率12。染菌对发酵生产率、提取率、得率、产品质量和三废治理等都有很大的影响。,消耗营养成分； 分泌某些使抗生素失去活性的物质，如青霉素酶能分解青霉素； 分泌代谢产物改变发酵液的pH值，抑制菌种的生产和产物的合成； 增加发酵液的粘度造成过滤困难和提取得率下降；,一、杂菌的危害,二、杂菌的检测,1显微镜检查 2无菌试验法 3试剂盒检验法,三、染菌发生的不同时间对发酵的影响及处理, 种子培养期染菌种子培养主要是使生产菌生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。, 发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。可重新灭菌，重新接种, 发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现，快处理。, 发酵后期染菌由于在发酵后期，培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵，或提前放罐。,四、发酵染菌原因分析, 染菌的杂菌种类分析 若污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，可能是由于培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等引起； 若污染的是球菌等不耐热杂菌，可能是由于种子带菌、空气过滤效率低、设备渗漏和操作问题等引起；, 发酵染菌的规模分析, 大批量发酵罐染菌空气过滤器介质失效等问题； 部分发酵罐染菌连消系统灭菌不彻底；也可能是中间补料染菌， 个别发酵罐连续染菌 大都是由于设备渗漏造成。,第十节、发酵终点的判断,（一）经济因素：降低成本，延长时间虽可略为提高单位。但占罐，费电。 （二）产品质量因素：放罐过早，糖、氮残留较多，过晚，菌丝自溶，发酵液发粘，影响过滤。,第十节、发酵终点的判断,三、确定放罐的指标有： （1）产物产量高； （2）残糖量低； （3）菌体开始自溶，表现发酵液过滤速度慢、氨基酸含量、 pH升高，和菌丝形态如碎片增多等。,Flash3,Flash4,Flash5,思考题,Flash6,思考题,Flash7,思考题,Flash8,思考题,Flash10,思考题,Flash9,七、 溶氧对发酵的影响及控制,7.1 溶氧的影响： 初级代谢产物，如氨基酸发酵，与需氧量密切相关。 A.供氧充足，产量才最大，反之受到强烈的抑制。如谷氨酸发酵. B.供氧充足，产量最大，但限氧，产量影响不明显。如赖氨酸发酵。 C.供氧充足，产量受限制，而限氧产物最大。如亮氨酸发酵。 次级代谢也同样。,供养充足 限氧 举例 A. 产量大 抑制 谷氨酸 B. 产量大 影响不大 赖氨酸 C. 产量抑制 大 亮氨酸、苯丙氨酸 说明需氧发酵并不是溶氧愈大愈好。为什么会这样呢？这与氨基酸的生物合成途径有关。亮氨酸类合成并不经过三羟酸循环，因而供氧过量，反而起到抑制作用,酵母菌的固定化,1.每组40ml 2.5%海藻酸钠加4克上述酵母泥，搅拌均匀。酵母粉充分溶解。 2.将上述凝胶装入注射器中，滴入0.2 mol/L氯化钙中，控制滴速，用玻棒搅拌成珠。 3.用无离子水洗涤后备用。,玉米淀粉培养基准备,20克玉米淀粉，加200毫升水，搅拌加热到淀粉透明，加高温淀粉酶4ML，90保温2小时，碘反应显棕色。 糖化酶4ML ，60保温1-2小时，糖化完全后，加热至沸，过滤，蛋白胨5克，用糖量器测糖度，要求含糖量15%以上，灭菌备用。,固定化酵母的活化,在装有200 mL活化糖液的500mL三角瓶中，加入上述固定化酵母（加入前用无菌水冲洗），摇匀后用八层纱布封好瓶囗，放入30的恒温培养箱或摇瓶机中培养。培养过程中，检测残糖锤度，并记录。,酒精度的测定,准确量取100mL发酵成熟醪倒入500mL蒸馏瓶中，并加入等量的蒸馏水。蒸馏瓶用插有温度计的胶塞塞紧，连接好冷凝管，勿使漏气。用电炉加热，同时接通冷却水，馏出液收集于100mL容量瓶或量筒中。待馏出液达到刻度时，立即停止收集（注意：不能超过刻度）。将馏出液倒入量筒中，稍加搅动，使之均匀，将酒精计与温度计同时置入量筒，测定酒精度与温度。,