治伤活血胶囊质量标准研究.doc

治伤活血胶囊质量标准研究关键词：治伤活血胶囊；当归；三七；冰片；丹参；骨碎补； TLC；HPLC摘要：目的：建立治伤活血胶囊（当归；三七；冰片；丹参；骨碎补）的质量标准。方法：以冰片；丹参酮IIA为对照品，以当归；三七为对照药材进行薄层色谱鉴别，以阿魏酸为对照品，采用高效液相色谱方法进行含量测定。结果：阿魏酸平均回收率为99.8%，RSD为1.6%，薄层图谱斑点清晰，阴性对照无干扰。结论：结果准确，方法重复性好。治伤活血胶囊由当归、三七、乳香（制）、冰片、土鳖虫、自然铜（煅）、丹参、骨碎补八味药经提取加工制成。具补血活血，调经止痛，润肠通便之功效，用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡等症。为有效控制药品的质量，本文采用TLC法对当归；三七；冰片；丹参进行了定性鉴别，并采用了HPLC法对该方中当归主成分阿魏酸进行了定量控制。1、仪器与试药Agilent G1311A Quat Pump，G1314A VWD，G1379A DEGASSER，AT-330柱温箱，Thermo- C18（250mm4.6mm，5um）色谱柱，硅胶G薄层板（自制）。冰片对照品（中国药品生物制品检定所提供，编号为110743200504）。三七对照药材为阳性对照（中国药品生物制品检定所，批号：120941200807），丹参酮IIA对照品为阳性对照（中国药品生物制品检定所，批号：110766200417），当归对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120927200512）阿魏酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0773-9910）塞多利斯全自动电子天平，SG2200H超声波清洗器；色谱纯甲醇，其它试剂均为分析纯。2、定性研究2.1为方中冰片的薄层色谱鉴别。取本品内容物1g，加石油醚（30-60）15ml，超声处理2-3分钟，滤过，滤液低温浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取冰片对照品，加石油醚（30-60）制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺冰片的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30-60）醋酸乙酯（19：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105摄氏度烘数分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照液色谱无干扰（图1）。 图1冰片的TLC图1、冰片对照品 2、3、4、供试品溶液5、缺冰片阴性对照溶液22当归的鉴别取本品内容物6g，加乙醚40ml，超声处理10分钟，滤过，残渣备用，滤液挥去乙醚，残渣加乙醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。另取当归对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取缺当归的阴性样品液按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各5ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷乙酸乙酯（9：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。阴性对照液色谱无干扰（图2）。图2当归的TLC图1、当归对照药材2、3、4、供试品溶液 5、缺当归阴性对照溶液2.3三七的鉴别取【鉴别】（2.2）项下乙醚提取后的残渣，挥尽乙醚，加甲醇30ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次10ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材1g，加甲醇30ml同法制成对照药材溶液。取缺三七的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇醋酸乙酯水（4：1：5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105烘数分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同的主斑点；紫外光灯（365nm）下显相同颜色的荧光主斑点。阴性对照液色谱无干扰（图3）。日光下 荧光下 图3三七的TLC图1、三七对照药材 2、3、4、供试品溶液 5、缺三七阴性对照溶液2.4丹参的鉴别取本品内容物6g，加醋酸乙酯20ml，置水浴上加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品。另取丹参酮11A对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。取缺丹参的阴性样品按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯醋酸乙酯（19：1）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。阴性对照液色谱无干扰（图4）。图4丹参的TLC图1、丹参酮IIA对照品 2、3、4、供试品溶液 5、缺丹参阴性对照溶液3、定量研究3.1色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈甲醇1%醋酸溶液（1:1:5）为流动相；检测波长为313nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。3.2溶液的配制对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml含20ug的溶液，即得。供试品溶液的制备 取本品内容物约2.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0.5%碳酸钠溶液20ml，超声处理（功率150W，频率20kHz）30分钟，提取液移至离心管中，离心（转速为每分钟3000转）10分钟，取上清液，置分液漏斗中，沉淀再用0.5%的碳酸钠溶液洗涤3次，每次10ml，洗液并入同一分液漏斗中，用2%氯化钠溶液饱和的乙醚洗涤3次，每次20ml，弃去乙醚液，水溶液用盐酸调节ph值至12，再用2%氯化钠溶液饱和的乙醚振摇提取4次（25ml，25ml，20ml，20ml），必要时离心消除乳化层，合并乙醚提取液，回收乙醚至干，残渣用甲醇溶解，转移至25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（避光操作）。测定时用微孔滤膜（0.45m）滤过，取20l进样。阴性对照溶液的制备 按处方取不含当归的其它药材制成阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备，以上三种溶液按上述色谱条件进样，测定。结果阴性对照在阿魏酸峰相应的保留时间处无干扰。见图6。图6-1阿魏酸对照品溶液及治伤活血胶囊供试品溶液HPLC图谱阿魏酸对照品溶液HPLC图谱治伤活血胶囊供试品溶液HPLC图谱缺当归的阴性样品溶液HPLC图谱3.3线性关系考察 精密称取阿魏酸对照品10.6mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度。摇匀（212ug/ml），再分别精密吸取对照品母液适量，用甲醇溶液稀释成不同浓度的对照品溶液：10.6ug/ml、21.2ug/ml、42.4ug/ml、63.6ug/ml、84.8ug/ml。分别 精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各20ul，按正文中色谱条件分析，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，进样阿魏酸的量为横坐标绘制标准曲线（见阿魏酸对照品溶液标准曲线图），计算得回归方程：Y=5087215X+228190,R=0.9990。表明阿魏酸在0.212 ug1.696ug范围内具有良好线性关系。具体数据及标准曲线见下表。 线性关系考察结果阿魏酸浓度（ug/ml）10.621.242.463.684.8阿魏酸的量（ug）0.2120.4240.8481.2721.696峰面积1434435.22356330.64452793.86494167.48797145以峰面积积分值为纵坐标，阿魏酸的量为横坐标绘制标准曲线（见阿魏酸对照品溶液标准曲线图）：阿魏酸对照品溶液标准曲线图计算得回归方程：Y=5087215X+228190，R=0.9990。表明阿魏酸在0.212 ug1.696ug 范围内具有良好线性关系。3.4稳定性试验 取本品内容物约2.3g，研细，精密称定，按【含量测定】项下的方法制备供试品溶液，进样，测定，然后分别于第2小时、4小时、6小时、8小时分别进样，测定，对其稳定性进行考察。结果见下表。稳定性试验结果放置时间（h）峰面积RSD%024682210050.62209450.42202809.42149963.12173184.11.23.5精密度试验精密吸取阿魏酸对照品溶液（21.2g/ml）20l，重复进样5次，测定峰面积，（结果见表4），阿魏酸峰面积积分值的相对标准偏差小于2%，表明此法精密度良好。表4 精密度试验结果实验次数峰面积RSD%1234522225432220548.621505922207429.12166469.6 1.53.6重复性试验分别取同一批治伤活血胶囊样品5份，按正文中含量测定项下方法试验，测定阿魏酸的含量，结果见表5。样品中阿魏酸含量的相对标准偏差为1.27%，表明此法重复性良好。表5 重复性试验结果试验号 阿魏酸含量（ug/g） 平均含量（ug/g） RSD（%）1 212.92 218.43 216.8 216.34 1.274 219.45 214.23.7加样回收率试验采用加样回收法。取同一批已知含量的治伤活血胶囊精密称取样品约1g各5份，分别定量加入阿魏酸对照品适量，按正文中含量测定项下方法测定阿魏酸的含量。结果见表6，平均回收率为99.8%，相对标准偏差1.6%，表明此法回收率良好。实测阿魏酸量-取样相当阿魏酸量回收率= 100% 加入阿魏酸对照品量表6 回收率试验结果取样量（g）样品中阿魏酸量（ug）加入阿魏酸量（ug）实测阿魏酸量（ug）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）1.24721.24931.24981.24071.2400269.8270.3270.4268.4268.3285285285285285553.3561.8539.7552.8550.899.5102.398.199.899.199.81.64、讨论治伤活血胶囊主要由当归等八味药组成，本次实验对冰片的研究时，曾比较了超声处理提取方法，对比了环已烷氯仿醋酸乙酯（9：1：2）展开剂，比较了紫外光灯下（365nm）检视方法，结果以本文的方法较好。实验对三七的研究时，为了更能控制产品的质量，采用三七对照药材为阳性对照，曾比较了：氯仿醋酸乙酯甲醇水（10：4：1：5）；甲苯-甲酸乙酯-甲酸（6:6:0.1）；异辛烷苯氯仿醋酸乙酯甲酸（6:3:1.5:2:0.1）；正丁醇醋酸乙酯水（4：1：5）的上层溶液等多种展开剂，结果以展开剂展开后的斑点圆整，分离效果好。综上，本品由八味药材组成，对五味药材分别进行了定性、定量的分析，能有效地控制本品的质量。参 考 文 献1、中国药典2005年版一部2、中华本草上海科学技术出版社3、天然药物成分定量分析中国医药科技出版社4、苗明三等.现代实用中药质量控制技术5、国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编（经络肢体、脑系分册）6、国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编（内科、气血津液分册）