熊果酸对肝星状细胞NADPH 氧化酶-Hedgehog 信号通路的影响.doc

熊果酸对肝星状细胞NADPH 氧化酶-Hedgehog 信号通路的影响陈 璐1，何文华1，朱 萱1，李弼民1，张焜和2，施 凤1，张新华1 （330006 南昌，南昌大学第一附属医院消化内科1, 江西省消化疾病研究所2） 摘要 目的 探索熊果酸（ursolic acid，UA）对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的NADPH氧化酶（NOX）- Hedgehog（Hh）信号通路的影响。方法 将处于对数生长期的HSC-T6细胞分为6组：正常对照组；瘦素组（100ng/mL）；熊果酸自身对照组（50mol/L）；DPI自身对照组（20mol/L）；熊果酸干预组（瘦素+熊果酸）；DPI干预组（瘦素+DPI）。在药物作用12h后，提取总RNA，采用RT-PCR法检测Shh、Smo、Gli1/2的表达；药物作用HSC-T6 细胞24h后，提取总蛋白，采用Western blot分别检测Rac1和Gli2的表达；药物作用12、24h及48h后，采用MTT法检测HSC-T6细胞的增殖情况。结果 (1)RT-PCR分析显示，瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Smo mRNA表达较正常对照组升高（P<0.05）；Shh、Gli2 mRNA表达较正常对照组升高，但差异无统计学意义（P>0.05）； 熊果酸干预后Shh、Smo和Gli2 mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P<0.05）；DPI干预后Shh、Smo和Gli2 mRNA表达明显低于瘦素组及正常对照组（均P<0.05）；瘦素对HSC-T6细胞Gli1 mRNA的表达无影响，而熊果酸及DPI干预也不影响HSC-T6细胞Gli1 mRNA的表达。(2)Western blot分析显示，瘦素刺激HSC-T6细胞24h后，Rac1和 Gli2蛋白的表达较正常对照组升高（P<0.01）；熊果酸干预后Rac1和Gli2蛋白的表达明显低于瘦素组（P<0.01）；DPI干预Rac1和Gli2蛋白的表达低于瘦素组（P<0.01）。(3)熊果酸干预组、DPI干预组12h后细胞生长抑制率均显著高于瘦素组（均P<0.01）。随着作用时间延长，熊果酸干预组和DPI干预组的生长抑制率进一步增加。结论 熊果酸能抑制瘦素诱导的HSC-T6细胞Hh信号通路Shh、smo、Gli2 mRNA和 Gli2蛋白表达。熊果酸通过抑制NOX亚基Rac1蛋白表达进而抑制Hh信号通路可能是它抑制肝星状细胞生长增殖的机制之一。关键词 熊果酸；肝星状细胞；Hdeghog信号通路；NADPH氧化酶；Rac1中图法分类号 文献标志码 AThe effect of ursolic acid on NADPH oxidases - Hedgehog signaling network in hepatic stellate cellsChen Lu, He Wenhua, Zhu Xuan ,Li Bimin, Zhang Kunhe, Shi Feng, Zhang XinHua(Department of Gastroenterology, First affliated Hospital of Nanchang University, Nanchang，330006,China)Abstract Objective Hedgehog（Hh） pathway modulates the activation and proliferation of hepatic stellate cells. NADPH oxidases (NOX) may be involved in the activation of Hh pathway. The purpose of this study is to explore the effects of ursolic acid (UA) on NOX-Hh signaling network in rat hepatic stellate cells (HSC-T6).Methods Culture-activated HSC-T6 cells were divided into six groups: normal control group; leptin group received leptin (100ng/ml); the intervention groups were pretreated with UA (50M)or NOX inhibitor DPI(20M), then stimulated with leptin for different times. Shh, Smo and Gli1 / 2 mRNA expression were detected by RT-PCR. Rac1 and Gli2 protein expression were analyzed with Western-blotting.; HSC-T6 cell proliferation were detected by MTT assay.Result 1 . RT-PCR analysis showed that Smo mRNA expression increased when leptin stimulated HSC-T6 cells for 12h. Shh and Gli2 mRNA expression also increased compared with normal control group , but there were no statistically significant difference (P > 0.05 ) ; Pretreated with UA or DPI significantly down-regulate Shh, Smo and Gli2 mRNA expression than the leptin group and normal control group( all P <0.05). Leptin, UA and DPI did not affect Gli1 mRNA expression. 2. Western blotting analysis showed that Rac1 and Gli2 protein expression increased when leptin stimulated HSC-T6 cells for 12h; Pretreated with UA or DPI significantly down-regulate Rac1 and Gli2 protein expression (all P <0.01); 3. ursolic acid intervention group , DPI intervention group after 12h of cell growth inhibition was significantly higher than leptin group ( all P <0.01). With the prolonged duration of action , leptin inhibition rate further decreased, while ursolic acid group , DPI group growth inhibition rate gradually increased. 3. The cell growth inhibition rate were significantly higher in UA intervention group and DPI intervention group than leptin group (all P <0.01). With the prolonged duration of action, their growth inhibition rate were further increased.Conclusions UA can inhibit expression of Shh，Smo，Gli2 mRNA and down-regulate expression of Gli2 protein of hedgehog signal pathway in HSC-T6 induced by the leptin. The mechanism of UA inhibit HSC-T6 growth and proliferation may be that UA inhibited NOX subunit Rac1 protein expression then inhibit Hh signaling pathway. Key words ursolic acid; hepatic stellate cells; hedgehog signal pathway; NOX;Rac1 Supported by the National Natural Science Foundation (81260082) and Natural Science Foundation of Jiangxi Province（20122BAB205019）,Corresponding author: Zhu Xuan, Tel:86-791-8692505,E-mail: jyyfyzx163.com基金项目 国家自然基金（81260082）；江西省自然基金（20122BAB205019） 通信作者 朱 萱，电话,(0791)8692505,E-mail: jyyfyzx163.com 近年研究表明，Hh（hedgehog）信号通路参与肝纤维化的发生 1。死亡的肝细胞能够释放Hh配体2，激活的Hh信号通路能够促进静止的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化成为肌成纤维细胞（muscle into fibrous ，MFB）3-4。MFB自分泌或旁分泌的Hh配体使Hh信号通路持续激活的状态，促进HSC增殖、抑制凋亡5。Choi等6发现瘦素与ObR结合后通过P13K/Akt途径激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化。NADPH氧化酶（NADPH oxidase, NOX）在肝纤维化发病中参与许多信号通路的调控 。最近有研究发现NOX参与对Hh信号通路的调控，NOX亚基 Rac1能激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化并抑制MFB的凋亡7。本课题组在前期研究发现，中药单体熊果酸（ursolic acid，UA）能下调HSC-T6中NOX亚基Rac1、p22PhoxmRNA表达及p47Phox的膜移位，抑制NOX活性而抑制ERK1/2信号通路、JAK2- STAT3信号通路活化，而减少I型胶原的产生并抑制HSC-T6细胞的增殖8-10。本研究拟进一步观察熊果酸抑制NOX亚基Rac1表达后，是否影响Hh信号通路的激活。1 材料与方法1.1 材料与试剂DMEM （高糖）购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，重组大鼠瘦素购自美国PeproTech公司，熊果酸、DPI均购自Sigma-Aldrich公司，LY294002、SB203580购自碧云天生物技术研究所，Trizol、dNTP、Oligo(dT)15、Taq PCR MasterMix、DNA Marker I、2Taq PCR MasterMix购自北京天根生化科技有限公司，M-MLV Reverse Transcriptase购自美国Promega公司，NOX亚基的引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成；四唑盐(MTT) 购自普利来基因技术有限公司，Mouse Anti-actin Monoclonal Antibody、北京中杉金桥公司，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购自美国Cell Signaling Technology公司，Anti-Rac1 antibody、Anti-Gli2 antibody、Anti-Cytochrome b245 Light Chain antibody购自英国abcam公司。1.2 细胞培养与分组HSC-T6细胞（大鼠肝星状细胞株）由上海中医药大学肝病研究所提供。细胞用含10%胎牛血清、青霉素(120 g/mL)和链霉素 (100g/mL)的DMEM培养液，在37、5 CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至80%90%密度时，分组传代至培养瓶继续培养。按加入药物不同，将细胞分为5组：正常对照组（给予含0.1二甲基亚砜的DMEM培养液）、瘦素刺激组(100 ng/mL)、熊果酸对照组（50mol/L）、DPI对照组（DPI 20mol/L）、熊果酸干预组（熊果酸50mol/L +瘦素）、DPI干预组（DPI 20mol/L +瘦素）。当细胞铺满孔底面积70%80%时，吸去原培养液，干预组加入含不同药物的培养液预处理30min，再加入瘦素孵育12、24 h或48h；瘦素刺激组、熊果酸对照组和DPI对照组不经预处理，直接加入相应药物孵育。1.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Shh、Smo、Gli1/2mRNA的表达培养瓶中的各组细胞进行不同的药物处理12h后，按Trizol试剂说明书提取总RNA，并反转录成cDNA。大鼠型胶原和-actin引物序列采用Primer Premier 5.0软件设计（引物序列见表1），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应参数：预变性，95，5min；变性，94，30s；退火，Shh、Smo、Gli1/2和-actin的退火温度分别是：55、57、56和55，30s；延伸，72，1min；终末延伸，72，7min；保存，4，10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统进行摄像和灰度值扫描并作相对量分析，将每组所测的型胶原mRNA灰度值，分别与相对应的-actin mRNA的灰度值相比较，计算出两者的灰度值比，实验重复6次。表 1 Shh、Gli1/2和-actin引物序列基因序列扩增长度 (bp)Shh正义链 ：5-CTGGCCAGATGTTTTCTGGT-3117反义链 ：5-TAAAGGGGTCAGCTTTTTGG-3Smo正义链：5GCCTGGTGCTTATTGTGG 375反义链：5GGTGGTTGCTCTTGATGG 3Gli1正义链 ：AACTCCACAGGCACACAGG-379反义链：GCTCAGGCTTCTCCTCTCTC-3Gli2正义链 ：CCATTCATAAGCGGAGCAAG-3105反义链：CCAGGTCTTCCTTGAGATCG-3-actin正义链 ：5-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3432反义链：5-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-31.4 Western blot检测Rac1和 Gli2蛋白的表达药物作用HSC-T6 细胞24h，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。配制10%的分离胶和5%浓缩胶。蛋白样品加入SDS上样缓冲液，100变性5min。聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜（NC膜），5的牛奶封闭2h，将NC膜放入一抗溶液中，4孵育过夜。Rac1抗体浓度11000，Gli2抗体浓度1800。洗膜后将NC膜置入二抗溶液中，孵育4h；再次洗膜后，采用化学发光液显影，用Molecular imager ChemiDocTM XRS分析系统进行曝光、摄像及灰度值扫描，将每组所测的Rac1、及Gli2的灰度值，分别与相对应的-actin的灰度值相比较，计算出两者的灰度值比。1.5 MTT法检测大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）细胞增殖待HSC-T6细胞生长融合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化后，细胞计数并接种至96孔板内，细胞密度约为每孔5000个，培养至细胞生长约占60%左右；按分组加药，每组另设6个复孔，分别培养12、24、48h；每孔加入无菌MTT溶液（5mg/mL）20L，继续放入培养箱中孵育4h后终止培养，每孔加入150L的二甲基亚砜（DMSO）振荡10min；在酶标仪上选择490nm波长检测各孔的吸光度（OD值）；细胞抑制率（%）（正常对照组OD值-实验组OD值）/正常对照组OD值100%。1.6 统计学处理实验数据以均数标准差表示，总体服从正态性分布，采用方差齐性行单因素方差分析（0ne way ANOVA）和SNK-q检验；如果不服从正态性分布或方差不齐，则采用秩和检验（包括Kruskal-Wallis H和Nemenyi法），使用SPSS13.0软件进行分析。2 结果2.1 熊果酸对肝星状细胞Shh mRNA表达的影响RT-PCR果显示（图1），各组HSC-T6细胞Shh mRNA表达差异有统计学意义（F=3.41，P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Shh mRNA表达(1.810.51)与正常对照组(1.730.89)间相比差异无统计学意义比（P>0.05）；熊果酸干预后Shh mRNA表达（1.090.46）明显低于瘦素组及正常对照组（P<0.05）；DPI干预组Shh mRNA表达（0.800.43）也显著低于瘦素组及正常对照组（P<0.01）；熊果酸干预组、熊果酸对照组与DPI干预组间相比，差异无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明熊果酸和NOX抑制剂DPI均能下调HSC-T6细胞Shh mRNA的表达。a：P<0.05,b：P<0.01,与正常对照组比较， c：P<0.05，与瘦素组比较；A：正常对照组；B：瘦素组；C：熊果酸对照组；D： DPI对照组；E；熊果酸干预组；F：DPI干预组图 1 RT-PCT检测各组HSC-T6细胞Shh mRNA的表达2.2 熊果酸对肝星状细胞Smo mRNA表达的影响RT-PCT结果显示（图2），各组HSC-T6细胞Smo mRNA表达差异有统计学意义（F=7.116，P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Smo mRNA表达较正常对照组升高（1.810.29）vs (1.390.33),P<0.05；熊果酸干预组Smo mRNA表达(1.180.30)明显低于瘦素组及正常对照组（P<0.01）；DPI干预组Smo mRNA表达（1.110.30）也显著低于瘦素组及正常对照组（P<0.01）；熊果酸干预组与DPI干预组间相比，两者之间差异无统计学意义（P>0.05）。熊果酸对照组、DPI对照组Smo mRNA表达均低于正常对照组（P<0.05），与相应的干预组之间相比无统计学差异；上述结果表明熊果酸、DPI均能下调瘦素介导的HSC-T6细胞Smo mRNA的表达。a：P<0.05，与正常对照组比较；b：P<0.01，与瘦素组比较；A：正常对照组；B：瘦素组；C：熊果酸对照组；D：DP对照I组；E：熊果酸干预组；F：DPI干预组图 2 RT-PCT检测各组HSC-T6细胞Smo mRNA的表达2.3 熊果酸对肝星状细胞Gli1/2 mRNA表达的影响RT-PCT结果显示（图3），各组HSC-T6细胞的Gli1 mRNA表达无统计学意义（F=0.487，P>0.05），但各组的Gli2 mRNA表达差异有统计学意义（F=2.587，P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后Gli2 mRNA表达较正常对照组升高，但无统计学意义（1.560.64） vs (1.280.44)，P>0.05；熊果酸干预组和DPI干预组的Gli2 mRNA表达均显著低于瘦素组 分别为(1.040.31) vs (1.560.64)，(1.000.14) vs (1.560.64)，均P<0.05，熊果酸干预组与DPI干预组间相比无统计学差异（均P>0.05）。上述结果表明，Gli1 mRNA表达不受瘦素及药物干预的影响，但瘦素可诱导Gli2 mRNA表达上调，熊果酸和DPI可抑制瘦素引起的HSC-T6细胞Gli2 mRNA的表达。a：P<0.01，与瘦素组比较；A：正常对照组；B：瘦素组；C：熊果酸对照组；D：DPI对照组；E：熊果酸干预组；F：DPI干预组图 3 RT-PCT检测各组 HSC-T6细胞Gli2 mRNA的表达2.4 熊果酸干预对瘦素诱导的NOX亚基Rac1蛋白的影响Western blot结果显示（图4），各组HSC-T6细胞的Rac1蛋白的表达差异有统计学意义（F值=45.29，P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞24h后Rac1蛋白的表达较正常对照组升高（1.700.24）vs (1.000.00)，P<0.01；熊果酸干预后Rac1蛋白的表达（0.510.06）显著低于瘦素组和正常对照组（P<0.01）；DPI干预组Rac1蛋白的表达（0.530.21）也低于瘦素组（P<0.01）；熊果酸干预组与DPI干预组组间相比，两者的Rac1蛋白的表达之间无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明熊果酸、DPI均能抑制瘦素诱导的NOX亚基蛋白Rac1的表达。a：P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，与瘦素组比较图 4 Western blot检测各组 HSC-T6细胞NOX亚基Rac1蛋白的表达2.5 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞Gli2蛋白的影响Western blot结果显示（图5），各组HSC-T6细胞Gli2蛋白的表达差异有统计学意义（F值=15.921，P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞24h后，细胞内Gli2蛋白的表达较正常对照组升高（2.010.30）vs (1.000.00)，P<0.01；熊果酸干预后Gli2蛋白的表达明显低于瘦素组（0.560.33）vs (2.010.30)， P<0.01；DPI干预组Gli2蛋白的表达低于瘦素组（0.600.56）vs (2.010.30)，P<0.01；熊果酸干预组与DPI干预组组间相比，差异无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明熊果酸和NOX抑制剂DPI均可以抑制瘦素诱导的Gli2蛋白的表达。a：P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，与瘦素组比较图 5 Western blot检测各组HSC-T6细胞Gli2蛋白的表达2.7 熊果酸对瘦素诱导的HSC-T6细胞增殖的影响MTT分析所示（表2），各组处理12、24、48h后HSC-T6细胞生长抑制率的差异有统计学意义（F值分别为514.17、3080.50和4140.42，均P<0.05）。瘦素刺激HSC-T6细胞12h后细胞生长抑制率（-46.691.27）%显著低于正常对照组（P<0.01），并随时间延长细胞生长抑制率进一步降低；熊果酸干预组、DPI干预组12h后细胞生长抑制率均显著高于瘦素组 分别为(-1.104.62)% vs (-46.691.27)%、(9.234.52%)vs(-46.691.27)%，均P<0.01。熊果酸干预组各时间点之间没有统计学差异（P>0.05）。上述结果表明瘦素可以促进HSC-T6细胞的增殖，并随着处理时间延长，其促增殖用增强。熊果酸及DPI可以完全抑制瘦素诱导的细胞增殖作用。表 2 MTT法检测各组12、24h及48h HSC-T6细胞的生长抑制率变化 (,n=3)时间组别各时间抑制率（100%）F值P值12h24h48h瘦素组-46.691.27-49.894.80-82.968.6883.8900.000熊果酸对照组42.727.8759.814.9377.723.55167.3170.000DPI对照组58.834.9474.593.6686.111.66249.5580.000熊果酸干预组-1.104.62-1.211.69-1.951.970.4120.664DPI干预组9.234.526.532.543.452.4013.8340.0003 讨论近年来研究发现Hh信号通路也与肝脏损伤修复及肝纤维化的发生有密切关系1。当肝脏受损后, Hh配体Shh结合于跨膜受体Ptch,诱导它从原始纤毛上解离11,并解除对跨膜蛋白Smo的抑制，而Smo激活至细胞核内的Gli转录因子家族，从而调控基因的表达 12。因此Hh信号通路的激活与否，最终取决于锌指转录因子Gli表达情况。在脊椎动物中存在3种Gli的同源基因，分别是Gli1、Gli2及Gli3 13-14。本研究证明活化的肝星状细胞（HSC-T6）有Shh、Smo、Gli1/2 基因的表达。Choi等6发现瘦素与ObR结合后通过P13K/Akt途径激活Hh信号通路，促进Q-HSC向MFB转化。本研究中也以瘦素作为促进肝纤维化的因子，发现它可以上调Hh信号通路中Shh、Smo及Gli2的mRNA表达，但Gli1 mRNA表达却没有明显变化，推测瘦素激活Hh信号通路后Gli2是参与肝星状细胞增殖、参与肝纤维化的重要转录因子。NOX在肝纤维化发病中也起重要作用，De Minicis S等15研究发现瘦素通过JAK激活NOX产生ROS，以氧化还原方式活化AKT、ERK1/2等下游信号通路，引起SC增殖、纤维生成及炎症反应。新近研究报道NOX亚基Rac1可激活Hh信号通路，促进HSC由静止型向活化型转变7。本研究通过Western blot检测发现瘦素可上调NOX亚基Rac1蛋白和Hh信号通路Gli2蛋白的表达，并且瘦素通过NOX激活Hh信号通路后，促进了肝星状细胞增殖。本课题组在前期研究发现，中药单体熊果酸能下调HSC-T6中NOX亚基Rac1、p22PhoxmRNA表达及p47Phox的膜移位，但熊果酸是否能抑制Rac1蛋白表达以及Hh信号通路的活化尚不清楚前期研究是否发表？。我们在瘦素作用HSC-T6细胞前给予熊果酸干预，发现熊果酸下调了Hh信号通路的Shh、Smo和Gli2的mRNA表达，说明熊果酸可抑制Hh信号通路主要分子的基因表达。进一步行Western blot检测显示，熊果酸显著抑制了瘦素诱导的Rac1蛋白表达，并且下调Gli2蛋白表达，说明熊果酸能阻断瘦素诱导的NOX-Hh信号通路的激活。Hh信号通路激活会促进HSC的增殖 4,16，我们在前期研究显示熊果酸能够抑制HSC-T6细胞增殖，促进其凋亡17。本研究通过MTT检测进一步证实熊果酸能抑制HSC-T6细胞增殖，提示熊果酸抑制NOX-Hh信号通路是其抑制HSC-T6细胞增殖的机制之一。参考文献：1 Wynn,T.A.Celluar and molelcular mechanisms of fibrosisJ.J Pathol，2008 ，214(2)：199-210.2 Jung Y, Witek RP, Syn WK, et al. 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Activation of Rac1 promotes hedgehog-mediated acquisition of the myofibroblastic phenotype in rat and human hepatic stellate cells. Hepatology. 2010;52(1):278-290.8 何文华,朱萱,李弼民,等.熊果酸对肝星状细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的影响J.中华消化杂志，2011,31(7)：484-486.9 张新华,何文华,朱萱等.熊果酸对活化型肝星状细胞NOX亚基p47Phox及ERK1/2信号通路活化的影响J.第二军医大学学报,2012 , 33(6 ):590-594.10 刘戈云,何文华,李弼民,等.熊果酸对瘦素诱导的肝星状细胞JAK2-STAT3活化及活性氧产生的影响J.第三军医大学学报,2011,33(19):2016-2020. 11 Rohatgi R, Milenkovic L, Scott MP. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary ciliumJ.Science ，2007，317:372-376.12 Lees C, Howie S, Sartor RB, et al.The hedgehog signalling pathway in the gastrointestinal tract: implications for development, homeostasis, and diseaseJ.Gastroenterology, 2005, 129(5): 1696- 1710.13 Bai CB, Stephen D, Joyner AL. All mouse ventral spinal cord patterning by hedgehog is Gli dependent and involves an activator function of Gli3. Dev Cell. 2004;6(1):103-115.14 Kasper M, Regl G, Frischauf AM, et al. 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