限制性酶切与连接.ppt
实验十 限制性酶切与连接,一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors 主要载体：质粒、噬菌体、病毒 功能：克隆载体（构建基因组文库或cDNA 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体,载体（Vectors）,如何构建所需要的载体？,一、DNA的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。,根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1. 限制性内切酶的类型,第二类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。 限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1. 限制性内切酶的类型,粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,2. 限制性核酸内切酶的命名法,由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,注意事项限制性内切酶酶切,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,：,反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基； TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,连接反应-连接酶（ligase）,ligase 又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等 连接酶的催化反应过程需要Mg离子,T4 DNA 连接酶催化双链DNA相邻核苷酸的5-磷酸和 3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能 催化RNA 连接到 DNA 或者双链RNA 上，但不催化单链核酸的连接。 把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1, 1:3 或 3:1 的载体:插入片段摩尔比,连接反应-T4连接酶,反应体系： 载体 DNA 100ng 插入片段DNA 17ng 连接酶 10X 缓冲液 1l T4 DNA 连接酶 (Weiss 单位) 0.11u 无核酸酶水加至 10ul 2. 孵育反应于：室温下3 小时，或4C 过夜，或15C，418 小时。,实验步骤与试剂（酶切）,质粒pUC18 DNA PCR产物 Hind内切酶 Hind 10 X buffer ddH2O,实验步骤与试剂,反应体系,质粒pUC18 DNA 2 l PCR产物 2 l Hind内切酶 2 l Hind 10 X buffer 2 l ddH2O 12 l,总体系为20 l，混匀,反应步骤,37C 酶切2h（各位老师上课只要求1h，自己改一下） 65C 灭活10min 琼脂糖电泳检测,内切酶失活 DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 条件不适（试剂、温度） DNA酶切位点上的碱基被甲基化 DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） DNA位点上存在其它修饰 DNA不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 将DNA底物与DAN混匀进行切割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,限制性内切酶酶切常见问题分析,问题一：DNA完全没有被内切酶切割,原因,对 策,内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 同上 同上 反应前离心数秒 将内切酶稀释，增大取样体积 电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 使用最佳反应体系 加大酶量5-10倍,问题二：DNA切割不完全,原因,对 策,限制性内切酶酶切常见问题分析,内切酶星状活性 其它内切酶污染 底物中含其它DNA杂质,检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量 用DNA作底物检查酶切结果 电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段,问题三：DNA片段数目多于理论值,原因,对 策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA定量错误（如RNA含量较高） 在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到DNA片段的存在,原因,对 策,限制性内切酶酶切常见问题分析,保存温度不合适 以稀释形式保存 贮藏缓冲液不适当 低蛋白浓度,内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20低温保存 稀释酶液不宜长期存放，应一次使用 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对 策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA上结合有蛋白质 内切酶中含有DNA外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一,原因,对 策,DNA电泳常见问题分析,含磷酸盐的浓度高 内切酶失活不全或含有ATP酶 平末端连接 外切酶污染 连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA 加大T4 DNA Ligase用量 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA 重新配制连接缓冲液,DNA电泳常见问题分析,问题七：酶切后的DNA片段连接效率低,原因,对 策,DNA降解 电泳缓冲液陈旧 所用电泳条件不合适 DNA上样量过多 DNA样含盐过高 有蛋白污染 DNA变性,避免核酸酶污染 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液 电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力 减少凝胶中DNA上样量 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐 电泳前酚抽提去除蛋白 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA,DNA电泳常见问题分析,问题一：DNA带模糊,原因,对 策,对于/Hind III片段cos位点复性 电泳条件不合适 DNA变性,电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟 电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热,问题二：不规则DNA带迁移,对 策,原因,DNA电泳常见问题分析,DNA的上样量不够 DNA降解 DNA走出凝胶 对于EB染色的DNA，所用光源不合适,增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低 避免DNA的核酸酶污染 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 应用短波长（254nm）的紫外光源,问题三：带弱或无DNA带,对 策,原因,DNA电泳常见问题分析,小DNA带走出凝胶 分子大小相近的DNA带不易分辨 DNA 变性 DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA 在脉冲凝胶电泳上分析,问题四：DNA带缺失,对 策,原因,DNA电泳常见问题分析,
