高效毛细管电泳在蛋白质分析中应用.ppt
高效毛细管电泳在蛋白质分析中的应用,一、概述,随着现代生物技术的不断发展 及各种新型蛋白质类生化药物的相继问世传统的SDS一聚丙烯酰胺电泳及常规的液相色谱技术已远远不能适应大规模药物生产过程分析与产品纯度检验的需要， 而毛细管电泳(HPCE)技术是近年来迅速发展起来的一种新型分离、分析技术。具有高效、快速、简便、微量的优异特点。该技术在生物大分子、无机离子、光学异构体及有机药物分离、分析方面获得了广泛的应用 。,分离原理,毛细管电泳的分离模式,毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会.根据分离原理可分为: 毛细管区带电泳CZE 胶束电动毛细管色谱MEKC 等电聚焦CIEF、等速电泳 CITP、 凝胶电泳CGE 毛细管电色谱CEC 亲和毛细管电泳ACE、免疫毛细管电泳CETA 非水毛细管电泳NACE 芯片电泳等,毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis ，CZE,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 是最基本、应用广的分离模式,毛细管等电聚焦电泳（CIEF，isoelectric focusing electrophoresis）,利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带，也同时达到浓缩的作用。,毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 常用于蛋白质、DNA等的分离，是DAN排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 是色谱与电泳分离模式的结合,毛细管电泳分离模式选择,根据简单通用性原则,还是以CZE、MEKC为优，分离中性离子时优先考虑MEKC 在分离生物样品时,通常需要根据分离的目的来选择分离方式,若测定样品的尺寸,就须选NGCE或CGE,偶可选CZE或MEKC,要测定样品的等电点,则应选用CIEF,在做亲和作用研究时,应首选ACE. 分离蛋白质和多肽等两性样品时优先考虑CIEF 分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式,CE技术的应用,毛细管电泳技术不仅广泛应用于环境保护、生物化学、医学卫生、临床检测、司法、食品卫生、药品检测、农业化学等领，在临床医学等领域的应用也有较多应用,CE在蛋白质分离分析中的应用主要包括：,肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，以及蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、稳定性和动力学研究。 蛋白的鉴别分析通常包括对氨基酸的组成和序列、一些物化常数如分子量和等电点等的测定，以区分和鉴定结构和种类不同的蛋白质,氨基酸与蛋白质分析analysis of amino acids,蛋白质分析,核酸分析及DNA排序 analysis of nucleic acids and sequence of DNA,重要分析手段； 图，酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离；,蛋白质的尺寸分离,蛋白质的尺寸分离或分子量测定，是化学等研究中的重要工作，通常利用超速离心、质谱、凝胶排斥色谱、SDS-PAGE等方法完成。利用毛细管电泳有较其他方法的优点：. 只需消耗纳升级的样品；. 可在短时间内进行重复和自动化的测定 . 如果能获得准确的分子量标准，可以比较准确的测定未知蛋白质的分子量；. 利用紫外等进行柱上检测，可以实现定量分析等；,蛋白质尺寸分析的关键，首先是筛分介质的选择，其次是缓冲体系的确定，此外还需需要仔细考虑进样、分离电压和电泳温度等因素。,常用的筛分介质有两大类，一是各种凝胶，应用于CGE,适合于蛋白质分离的凝胶有线性聚丙烯酰胺、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖等。二是水溶性高分子溶液或称非胶筛分介质，用于NGCE，最好选用紫外透明或吸收较弱的高分子，例如葡聚糖、聚乙二醇等。,蛋白质对毛细管内壁的吸附某种程度上限制了毛细管电泳在该领域的应用。 影响毛细管电泳分离蛋白质效率及重现性的最主要因素是毛细管壁对蛋白质的吸附, 吸附作用的大小取决于毛细管材料、蛋白质的等电点、缓冲溶液的pH 值等多种因素。,存在的问题,毛细管内壁对蛋白质产生吸附的原因,毛细管电泳中的蛋白质吸附, 可源于疏水作用、静电作用和其它多种两相分配机制。通常情况下碱性蛋白的静电吸附最为突出,在常用缓冲溶液的pH 下( pH= 4 8) , 管内壁的硅羟基发生解离, 使管内壁带负电荷,蛋白质在低于等电点时会带上正电荷, 在高于等电点时带负电荷。,若缓冲溶液的pH 值低于蛋白质等电点, 蛋白质则吸附H+ 而带正电荷, 由于静电相互作用,蛋白质与管壁发生吸附当pH 值增大到接近等电点时, 蛋白质显中性, 不带电; pH 值继续增大( 超过等电点) , 蛋白质带负电, 此时与毛细管壁的Si O- 产生排斥作用, 不再发生吸附。,( a) 碱性蛋白质( pI= 8) 所带电荷量随pH 的变化曲线; ( b) 在pH= 4 时, 碱性蛋白质( pI= 8) 与毛细管壁发生吸附,解决办法,1、极端pH值法 缓冲溶液pH 值通过影响柱壁与溶质的电荷差异, 从而改变其间的相互作用。 在低pH 下, 硅羟基主要以不带电的质子化形式存在, 壁电荷非常小, 可以减少吸附。在高pH 值下, 内壁表面SiOH 基大部分电离带负电荷, 与溶液中带负电荷的蛋白质产生库仑排斥作用, 从而有效地抑制了管壁的吸附。,2、添加小分子添加剂 在CE 分离中, 除了背景电解质外, 常常还在缓冲溶液中添加某种成分, 常用添加剂有 : 表面活性剂, 如季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂; 中性盐, 如磷酸盐、硫酸钾等; 胺类, 三乙醇胺 、三乙胺、N-乙基二乙醇胺 、N , N, N, N-四甲基-1, 3 丁二胺( TMBD) 等; 有机溶剂, 包括醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜等。 上述两种方法只能从一定程度上降低蛋白质吸附, 而且pH 值过高( 或过低) , 小分子添加剂浓度过大都会导致蛋白质聚集和变性。,3 、聚合物涂覆毛细管内壁抑制蛋白质吸附 化学键合涂层的涂覆过程如图2 所示, 一般分为两大步: 首先, 硅烷化试剂与毛细管内壁的Si OH反应生成Si -O - Si 结构固定在管壁内表面; 然后, 通过硅烷化试剂末端双键与适宜单体共聚生成聚合物覆盖在毛细管内表面, 形成永久涂层。,常见的化学键合聚合物涂层有以下几种: 聚丙烯酰胺( PAA) 聚乙烯醇( PVA) 聚乙二醇( PEG) 聚N , N-二甲基丙烯酰胺( PDMA) 通过共价键与毛细管壁结合的涂层寿命长, 稳定性好, 分离效率高, 已在毛细管电泳中获得广泛应用, 但是化学键合的过程中涉及毛细管硅烷化和引发单体聚合两步反应, 一方面受两步反应的转化率影响, Si- OH 很难被完全屏蔽; 另一方面, 毛细管内的聚合反应很难控制, 容易造成涂层的不均一性、不规整性, 甚至阻塞毛细管。,化学键合的交联的PVA 涂层对4 种碱性蛋白质实现第2 次和第902 次分离的电泳图谱 样品浓度: 50ug/mL 的( 1) 细胞色素C, ( 2) 溶解酵素, (3) 胰蛋白酶原, ( 4) 胰凝乳蛋白酶原。分离条件: 毛细管, 内径50m, 总长48cm( 有效长度40cm) ; 注入, 3 kV, 5 s; 缓冲液, 40mM 磷酸钠; 分离, 309 V/cm,物理吸附的毛细管涂层 通过物理作用吸附在毛细管壁上的聚合物涂层相对于化学键合涂层优势在于: ( 1) 涂层制备过程简单易操作, 涂覆过程可一步完成, 比化学键合的涂层省去了硅烷化步骤, 聚合物直接通过物理作用( 包括氢键, 静电引力和疏水基团间的相互作用) 吸附在管壁上; ( 2) 涂层可再生。这种涂层可以是中性的、带正电荷的、也可以是吸附在带正电的聚合物涂层表面转而带负电荷的。,无胶筛分毛细管电泳(non-gel sieving capillary electrophoresis，NGCE),是近年来发展起来的一种用于检测核酸的新方法，与毛细管凝胶电泳相比，具有向毛细管内注入筛分介质方便，易于冲洗，毛细管可反复使用，以及便于实现自动化等优点。 NGCE一般以非交联的高分子水溶性化合物作筛分介质，常用的有水溶性纤维素衍生物、聚吡咯烷酮、线性聚丙烯酰胺等。可采用非涂层管，以大分子聚乙二醇为筛分介质，以NGCE模式进行蛋白质样品的检测。,三、 仪器设备,1、高压电源系列CL101系列 包含：CL101A 智能高压电源（正） CL101B 智能高压电源（负） CL101C 智能高压电源（正负） CL101D 多路智能高压电源 CL101E 高压电源（恒流、正） CL101F 高压电源（恒流、负）,技术指标,输出电压：030KV，连续可调(正电源)（标配） 输出电压：0-30KV，连续可调(负电源)（选配） 输出电流范围：0999A 电源调节率： 电源电压变化10%， 输出电压变化0.01% 负载调节： 10V/100A 纹 波： 输出电压的0.1% P-P 电压示值误差：2.0% 电流示值误差：3.0% 稳定度变化： 1.5%,CL101A 智能高压电源正,CL101B 智能高压电源负,CL101C 智能高压电源正负,CL101E高压电源正,2、CL1020高效毛细管电泳仪紫外检测器 包含： 国产紫外检测器 电泳机箱 高压电源 工作站 紫外检测池,工作原理,紫外检测原理基于被测组分和背景电解质的吸光度不同，当被测组分通过检测窗时，吸光度发生的变化服从朗伯-比尔定律，即在一定的实验条件下，吸光度与被测组分的浓度成正比。,技术指标 光路系统：进口设计衍射光栅单色仪， 进口光电池 灯 源：日本滨松L6302氘灯 波长范围：190700nm，连续可调 波长精度：2nm；波长重复性：0.4nm 噪 声：1.510-5AU 在254nm，t=1s 漂 移：410-4AU/h 在254nm，t=1s 检 测 限：110-6g/ml(对氨基苯甲酸) 定性重复性：RSD1.3%； 定量重复性：RSD3.0%,仪器特点,分离效率高，分析速度快，检测灵敏度高 试剂用量少，样品预处理简单 微处理器控制，波长重复性高，检测范围宽 可变波长选择，190700nm连续可调 液晶屏幕显示，轻触面板，程控找波长，自动调零 独特的氘灯温度控制方式，氘灯使用寿命可达2500小时 进样方式：电进样 030KV可调，压差进样130 230mm可调 冲洗方式：弹簧加压冲洗,3、CL1030高效毛细管电泳仪紫外检测器,包含： 诺尔紫外检测器 电泳机箱 高压电源 工作站 诺尔紫外检测池,技术指标,进口德国诺尔（Knauer）紫外检测器 光路系统：衍射光栅单色仪，光电二极管 灯 源：氘灯（标准），钨卤灯（选配） 波长范围：190740nm，连续可调 边缘滤波：370nm 波长精度：2nm 时间常数：0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/5.0/10.0s 扫描速度：全程范围扫描速度：100nm/s 模拟输出：1V 自动调零：全量程 GLP功能：详细报告，点灯时间和点灯次数 噪 声：1.510-5AU在254nm，t=1s 基线漂移：410-4AU/h在254nm，t=1s 检 测 限：110-6g/ml(对氨基苯甲酸) 定性重复性：RSD1.3%；定量重复性：RSD3.0%,4、CL3020高效毛细管电泳液相色谱一体机,包括： 国产紫外检测器 平流泵 高压电源 进样阀 色谱柱 毛细管电泳检测池 液相色谱检测池,性能介绍,CL3020高效毛细管电泳液相色谱一体机既具有高效液相色谱的功能，既具有高效毛细管电泳仪的所有功能，更换液相的流通池又可以做液相色谱分析。采用的是温分检测器，温分平流泵等梯度高压输液系统。此款仪器是为广大用户提供最优性价比的分析仪器。在生物学、药物学、食品科学、化学化工、农业、刑侦和环保等方面具有广泛的应用前景。,技术指标,CL3020高压输液泵 泵压力范围：0.0042Mpa 流量范围： 0.0110ml/min（分析型） 流量精度： 3l(0.01ml/min0.1ml/min) 1%(0.5ml/min10ml/min) 流量稳定度：0.3%,光路系统：衍射光栅单色仪，光电二极管 波长范围： 190700nm，连续可调 灯 源：日本滨松L6302氘灯 波长精度： 2nm； 波长重复性：1nm 衰减范围： 0.0022AU/mv 10档 噪 音： 1.510-5AU；基线漂移： 410-4AU/h 检 测 限： 110-6g/ml（对氨基苯甲酸，毛细管电泳） 210-8g/ml（萘的甲醇检出量，液相色谱） 定量重复性： RSD3.0%（毛细管电泳） 检测池体积： 4.5l（液相检测池）,CL3020紫外检测器,进口马达，进口驱动器，细分两万步，无机械噪声，确保精度 显示方式：液晶屏幕显示，轻触面板，程控找波长，自动调零 单柱塞往复泵，独特的单向阀设计，流动相无须脱气，进口密封系统，耐高压能力强 进口缓冲器，缓冲能力强，使脉动最小 显示模式：实际压力显示，流量设置，压力上下限设置 安全控制：压力上下限控制，蜂鸣报警，自动停机,仪器特点,全进口液路管，简单液路连接 可更换流通池，使之适用于分析型高效液相色谱和高效毛细管电泳分离系统 灯源：日本滨松L6302氘灯 微处理器控制，波长重复性高 独特的控制氘灯温度，启辉电压氘灯的使用寿命可达2500小时 专利的反压器设计，使气泡不易进入流通池 尺寸与重量：440420400（WDH）35kg,毛细管：50m(i.d)50cm，有效长度38cm，缓冲溶液：60mmol/L的柠檬酸缓冲溶液 工作电压：15KV；高差进样：10厘米20s；检测波长：230nm；,B 瘦肉精 HPLC色谱图,A 瘦肉精 HPCE色谱图,流动相：甲醇：水：磷酸：三乙胺=40：60：0.2：0.2 流速：0.8ml/min C18柱：25cm 波长：220nm,5、CL3020高效毛细管电泳液相色谱一体机,包括： 温分紫外检测器 温分三元低压梯度泵 高压电源 进样阀 色谱柱 毛细管电泳检测池 液相色谱检测池,性能介绍,毛细管电泳与液相色谱相比具有更加高效、快速、微量、经济等几大特点，是当代分离科学的最新成就。尤其在多肽、蛋白质、核酸等方面的分离显示出优越性能。CL3030高效毛细管电泳液相色谱一体机则集成高效液相色谱和高效毛细管电泳仪的所有功能，紫外检测器采用的是温分紫外检测器，液相输液泵可以按照用户的要求配置二元或三元梯度系统。,技术指标,CL3030高压输液泵 泵压力范围：0.0042Mpa 流量范围： 0.0115ml/min（分析型） 流量精度：3l(0.01ml/min0.1ml/min) 1%(0.5ml/min9.99ml/min) B液%精度：0.5%ABS,紫外检测器,光路系统：衍射光栅单色仪，光电二极管 波长范围：190700nm，连续可调 波长精度：2nm；波长重复性： 1nm 衰减范围：0.0022AU/mv 10档 噪 音：1.510-5AU； 基线漂移：410-4AU/h 检 测 限：110-6g/ml（对氨基苯甲酸，HPCE） 210-8g/ml（萘的甲醇检出量，HPLC） 定量重复性： RSD3.0%（HPCE） 检测池体积： 4.5l（HPLC）,1、安赛蜜2、糖精钠 3、苯甲酸 4、山梨酸 甲醇：0.02M乙酸铵35：65的溶液做流动相； 流速 0.5ml/min, 波长 230nm，柱子 25cm C-18色谱柱。,1、山梨酸 2、苯甲酸 3、糖精钠 4、安赛蜜 毛细管：50m(i.d)50cm，有效长度38cm，缓冲溶液：30mmol/L的硼砂溶液； 工作电压：25KV；高差进样：10厘米20s；检测波长：230nm；,A 防腐剂 HPCE色谱图,B 防腐剂 HPLC色谱图,蛋白质的分离,仪 器： Waters Quanta 4000 CE 检测器： UV-214nm 毛细管：75 pm ID60 cm，分离长度52cm 内壁修饰：无 进 样：虹吸30s 分离模式：FSCE 电场强度：Vcm 电 压：12kV 电 流：uA 温 度：室温 载体电解质溶液：33mmolL磷酸盐 pH 2.0,pl点以上蛋白质的分离,仪 器：CE 检测器：UV 毛细管：52 m101 cm，分离长度55cm 内壁修饰：无 进 样： 分离模式：FSCE 电场强度：Vcm 电 压：30kV 电 流：uA 温 度：室温 载体电解质溶液：20mmolL硼酸盐 pH 8.25,蛋白质的分离,仪 器：BioRad HPE lOO CE 检测器：UV一200nm 毛细管：50 um ID30 cm，分离长度cm 内壁修饰：PEG 400交联 进 样：电动进样，8kV，8s 分离模式：FSCE 电场强度：Vcm 电 压：8kV 电 流：uA 温 度：室温 载体电解质溶液：0.3molL硼酸盐,酸性和碱性蛋白质分离,仪 器：CE 检测器：UV一200rim 毛细管：50Um ID43 cm，分离长度3lcm 内壁修饰：F108 进 样：虹吸8cm，8s 分离模式：FSCE 电场强度：Vcm 电 压：1OkV 电 流：uA 温 度：室温 载体电解质溶液：1 0mmolL磷酸盐 pH 4.5,蛋白的分离,仪 器：CE 检测器： 毛细管：75Um cm，分离长度cm 内壁修饰：无 进 样：电动 分离模式：CGE(SDSPAGE) 电场强度：400Vcm 电 压：kV 电 流：24uA 温 度：27C 载体电解质溶液：90mmolL Tris一磷酸盐 8molL尿素 0.1SDS pH 8.6 Gel：10T，3.3C,聚赖氨酸的CGE分离,仪 器：Beckman 2100 PACE 检测器：UV一200nm 毛细管：75m ID37 cm，分离长度30cm 内壁修饰： 进 样： 分离模式：CGE 电场强度：Vcm 电 压：7kV 电 流：uA 温 度：25 载体电解质溶液：BisTris磷酸pH 6O 聚丙烯酰胺凝胶： 5T，5C,标准蛋白混合物的CIEF分离,仪 器：CE 检测器： 毛细管：um ID cm，分离长度cm 内壁修饰：聚丙烯酰胺涂覆 进 样： 分离模式： 电场强度：Vcm 电 压：kV 温 度：C 载体电解质溶液：pH 3-10,谢 谢！,
