高效毛细管电泳技术.ppt

高效毛细管电泳技术,一、高效毛细管电泳技术概述 二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件 三、高效毛细管电泳理论基础 四、高效毛细管电泳分离模式 五、高效毛细管电泳应用,1.1电泳及电泳技术,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。 由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。,1.2 高效毛细管电泳 （High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE）,简称毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE），指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分配技术。在形态分析中，对不同形态的同一元素，只要有结构或电荷上的差别，即可用CE进行分离和检测。CE是经典电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物。,2.1毛细管电泳的工作流程图,CE 设备的基本装置包括一个高压直流电源、一根毛细管、一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。,图1 高效毛细管电泳流程图,2.2主要部件,1.高压电源 （1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性； （5）电源极性易转换；,图2 高效毛细管电泳基本装置,2. 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径2075m，外径350400m；长度<=1m 3. 缓冲液池 化学惰性，机械稳定性好 4. 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；,3.1电泳现象,在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁移速度为：,试中：Vep为离子电泳迁移速度，ep为电泳淌度，E为电场强度, q为离子电荷量，为介质粘度，r为离子半径。,Vep=ep E=,q,6r, E,3.2电渗现象与电渗流,CE所用的石英毛细管柱，在pH3时，石英毛细管壁上的硅醇基( SiOH）在水溶液中发生电离，产生的SiO负离子使毛细管壁内表面带负电，和溶液接触时相应的缓冲液带正电，形成了双电层。,图3 毛细管电泳中形成双电层现象,在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动，该现象称为电渗现象，并形成电渗流（electro-osmotic flow, EOF）电渗流速度可表示为：,其中Veo为电渗流速度， eo 为电渗淌度， 为双电层的Zeta电位， 为分离介质的介电常数,Veo= eo E,E,=,图4 毛细管电泳的电渗现象和电渗流,3.3电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： （1）内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； （2）内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； （3）石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极。,3.4 HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,图5 毛细管电泳电渗流流形和液相色谱流形的比较。,3.5分离原理,粒子在电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和,即 V=Vep+Veo=(ep + eo ) E 1、正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出； 2、中性粒子的电泳速度为0，故其迁移速度相当于电渗流速度；,3、负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出。这样，各种粒子因迁移速度不同而实现了分离。,图6 各种离子的分离,四、分离模式,毛细管电泳,毛细管区带电泳（CZE） 毛细管胶束电动色谱（MECC） 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（CIEF）,根据试样的性质不同，可采用不同的分离模式。,4.1毛细管区带电泳（CZE）,CZE又称毛细管自由电泳，是毛细管电泳中最基本、应用最普遍的一种模式。它在毛细管中仅填充缓冲液，基于溶质组分在电场中的迁移速度不同而分离。前述的基本原理即是CZE的基本原理。,图7 区带毛细管电泳示意图,4.2毛细管胶束电动色谱（MECC）,MECC是在缓冲液中加入表面活性剂，当其浓度高于临界浓度时形成胶束。在电场力的作用下，毛细管水相可看作流动相，胶束相可看作“准固定相”，溶质由其在胶束相和水相中的分配系数不同而在不同时间流出。可以用来分离中性物质，扩展了高效毛细管的应用范围，同时也能和色谱技术联合起来。,图8 毛细管胶束电动色谱分离模式示意图,4.3毛细管凝胶电泳（CGE）,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，是DNA排序的重要手段。,4.4毛细管等电聚焦（CIEF）,1、根据等电点的差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2、毛细管内充有两性电解质,阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；当施加一定直流电压时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度； 3、氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,4、具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离； 5、加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测。,4.5毛细管电泳的特点,由于毛细管具有良好的散热效能，允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压，可以在很短的时间内达到很高的分离效率，具有以下特点： （1）分离速度快 （2）分离效率高 （3）运行成本低 （4）样品与试剂消耗量少 （5）可供选择的分离模式多，应用范围广 （6）分离一般在水溶液介质中进行 （7）方法简单，仪器自动化程度高,五、毛细管电泳的应用,5.1离子分析（analysis of ion） 阳离子分析： 迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了24种金属离子； 阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；,图9 阳离子分离毛细管电泳图,阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离子如：SO24-、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测； 常用于离子价态及存在形态分析。,图10 阴离子毛细管分离图,5.2药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段； 采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物。,采用MECC模式，鉴定违禁药物；,5.3手性化合物分析 合成获得单一手性化合物困难；检测分析非常困难；HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；根据形成配合物的稳定常数有差异进行分离和检测。,图11 违禁药物毛细管胶束电动色谱分离图,5.4氨基酸与蛋白质分析采用毛细管胶束电动色谱（MECC）模式，在25分钟内可以分离了23种氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪。,图12 23种氨基酸的毛细管胶束电动色谱图,5.5高效毛细管电泳在环境中的应用,1、CE成为元素形态分析的一种新型分离技术。目前用于形态分析的通用检测器主要是紫外分光检测器,主要方式是CZE。间接紫外检测法是指在缓冲液中加入具有紫外吸收的物质,当那些没有或有很小紫外吸收的分析物通过检测窗口时引起吸光度的减小,为自身没有发色团的无机离子及其无机和有机络合物提供了可能的检测方式。,间接紫外检测目前已应用于Fe(CN)64-/Fe(CN)63-,Fe()/Fe(),Fe()的络合物,铝的络合物,硒,铅,砷,锡,有机汞,Cr()/Cr()测定。用CE-UV法进行元素形态分析,虽然简单并且可用间接UV法检测那些无紫外吸收或紫外吸收很小的物质。,2、毛细管电泳-质谱联用技术可以鉴别和定量酚类化合物，多环芳烃化合物，多氯联苯化合物，亚硝胺类化合物等。 3、对农药残留物的分析，目前对除草剂分析较多。如百草枯、敌草快、水样品中氯代酸除草剂的分析等。,