油红染色方法.doc

原代细胞的脂类染色方法苏丹红染色法原理：苏丹红染料在脂类物质中的溶解度大于其在溶剂中的溶解度，如果染料与含有脂类的试样接触，便有大量染料进入脂类物质的结构内，使这些结构呈红色。多用苏丹红染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇染色，脂肪酸或胆碱可使四氧化锇还原为二氧化锇而呈黑色。配制试剂：1.苏丹红染色液：将1g苏丹红溶于加温的70%乙醇溶液中过滤备用；2.甲醛钙固定液：将10ml甲醛和1g CaCl2混合加水至100ml；3.甘油明胶：将12g明胶加入120ml蒸馏水中水浴加热使其完全溶解，再加入60ml甘油和1g苯酚，充分混匀后即得。于4储存备用；染色步骤：1.用Hanks液漂洗盖玻片3次；2.用甲醛钙固定液固定20min；3.用蒸馏水漂洗盖玻片3次；4.用70%乙醇将盖玻片冲洗3次；5.用苏丹红染色液覆盖盖片样品，染色1030min；6.用70%乙醇漂洗盖片3次；7.用甘油明胶封片后观察；结果：原代细胞含脂类的区域呈橘红色；1.染色液的配制材料：油红染料 棕色可密封瓶 异丙醇 研钵 漏斗 定性滤纸称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，棕色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释后数小时内用完。2.10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛（多聚甲醛） 密封瓶称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的三蒸水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。3.染色对象 间充质细胞脂肪诱导后不同时间段。4.培养载体 3毫升培养瓶。如果培养载体为塑料制品，hoechst33342染核的话，塑料板自发荧光也为蓝色，必须考虑。5.染色步骤：5.1 先小心轻缓倒去培养夜。5.2 用pbs轻缓漂洗（不洗没问题）。5.3 加10%中性甲醛固定30min（实际固定时间过夜都没问题。固定液用95%酒精也可）。固定的是细胞膜。5.4 稀释油红储存液，油红：去离子水3:2，滤纸过滤，室温放置10min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。5.5 染色10min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1.5ml，24孔加0.5-1ml（实际染色时间1小时都可以）。5.6 脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。5.7 复染，淡苏木染色1/5分钟，pbs漂洗（这一步不做也可，看试验需要，并且苏木素会把胞浆染红，如要显示核， hoechst33342也可以，浓度5微克/毫升染10分钟即可把核染上）。5.8甘油明胶封片（封片后可长期保存）。5.9 显微镜观察。注意事项：脂肪油红染色，有的是动物/人体脂肪组织切片，或细胞爬片。各有操作差异。以下是各论坛方法小结，不全。1.完全成熟饱满的脂肪细胞，容易破裂，脂滴泄漏，所以压片，切片都要考虑到这个问题。2.细胞爬片细胞溶液脱落，特别是脂滴大的。操作务要轻柔。不要把细胞冲掉。3.如果做脂肪组织冰冻切片，冰冻温度比普通要低，切片厚度加厚。