坐骨神经慢性压迫性损伤术后痛觉过敏的机制探讨.docx

坐骨神经慢性压迫性损伤术后痛觉过敏的机制探讨关键词：痛觉过敏; 突触可塑性; 轴突运输; 实时定量PCR; 坐骨神经损伤;Abstract：Objective: To explore the mechanism of hyperalgesia with sciatic nerve injury rats model in terms of synaptic plasticity and axonal transport. Methods: Peripheral neuropathic pain in rats were induced by chronic compression injury ( CCI) of sciatic nerve. The indexes of mechanical hyperalgesia, cold allodynia and thermal hyperalgesia in rats after CCI were detected. The expressions of GAP-43, NCAM, PSD-95, Syp, kinesin and dynein in the L4-6 dorsal root ganglion at 14 d and 21 d after CCI were detected by realtime quantitative PCR detection. Results: The indexes of mechanical hyperalgesia, cold allodynia and thermal hyperalgesia in rats in 14 d after CCI were reduced ( PKeyword：Hyperalgesia; Synaptic plasticity; Axonal transport; Real-time quantitative PCR; Sciatic nerve injury;痛觉过敏是神经病理性疼痛的疼痛表现, 指对正常刺激的敏感性增加1。疼痛感对自我保护、危险识别和控制伤害的延长等至关重要。然而, 组织损伤、慢性炎症和神经病理学均可诱导伤害性神经元可塑性, 从而导致病理性疼痛。最终, 疼痛成为疾病本身, 失去了维持身体完整性的保护特性2。坐骨神经结扎导致的慢性压迫性损伤已被广泛用于研究神经病理学疼痛的病理。因此, 本研究采用坐骨神经慢性压迫性损伤 (chronic compression injury, CCI) 作为实验动物神经性疼痛诱导模型3, 检测CCI术后大鼠的机械性痛觉过敏、冷触诱发痛以及热痛觉过敏随时间的变化。目前, 研究已经确定了触发神经性疼痛发作的细胞和分子信号, 但是慢性疼痛的自我修复机制在很大程度上还是未知的。研究4表明, 突触强度和功效的依赖性增加, 最终导致神经疼痛模型动物的慢性机械性触诱发痛。此外, 轴突运输障碍可能导致轴突机械敏感性和机械超敏反应5, 此机制为疼痛的研究提供了新的思路。本研究主要从突触可塑性以及轴突运输两方面探讨CCI术后痛觉过敏的机制, 探讨CCI对神经生长相关蛋白 (GAP-43) 、神经纤维粘附分子 (NCAM1) 、突触后致密蛋白 (PSD-95) 、突触体素 (Syp) 、驱动蛋白 (kinesin) 以及动力蛋白 (dynein) 的影响。1 资料和方法1.1 一般资料选用180221 g成年雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠40只, 购自西安交通大学医学院实验动物中心。实验动物在241的室温下自由喂食和饮水, 12/12光照/黑暗循环。将大鼠随机分为两组:Sham组 (假手术组, n=20) , CCI组 (坐骨神经损伤组, n=20) 。1.2 建立坐骨神经损伤模型采用CCI诱导大鼠外周神经性疼痛3。按体重对手术大鼠腹膜内注射40 mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉。在股肌肉下方做34 mm的深切, 暴露坐骨神经, 并用无菌4-0肠线在4个连续位点进行松扎, 间隔为1 mm。假手术组:只暴露坐骨神经而不结扎。之后, 两组均立即丝线缝合肌肉和皮肤层, 并应用局部抗生素。所有外科手术均在无菌条件下进行。1.3 疼痛超敏反应检测分别在术前1 d、术后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d对大鼠进行疼痛超敏反应测试。1.3.1 机械性痛觉过敏采用von Frey细丝评估机械性痛觉过敏6。将大鼠放入高架金属网底箱中, 通过电子von Frey丝缓慢匀速向大鼠后肢足底表面施加压力。记录大鼠足退缩或后肢回缩时的压力值, 记为缩足反射阈值 (PWT, g) 。每组测量3次, 间隔15 min, 取3次平均值。1.3.2 冷触诱发痛采用丙酮跌落试验检测冷触诱发痛7。将大鼠放入高架金属网底箱中, 向大鼠后爪足底表面喷洒100μL丙酮。记录大鼠缩足持续时间 (c-PWL, sec) 。每组测量3次, 间隔15 min, 取3次的平均值。1.3.3 热痛觉过敏采用Eddy’s热板评估热痛觉过敏8。保持温度在 (52.51.0) , 记录大鼠撤回后爪或舔爪的时间, 记为后爪热缩足反射阈值 (hPWL, sec) 。为避免后爪受伤, 设置15 s为截止时间。每组测量3次, 间隔15 min, 取3次的平均值。1.4 实时定量聚合酶链式反应 (qRT-PCR) 分析CCI后14 d, 分别取两组各10只大鼠同侧L4-6背根神经节 (DRG) 进行qRT-PCR分析。剩余大鼠继续进行行为学检测, CCI后21 d, 取两组各剩余的10只大鼠DRG进行qRT-PCR分析。用Trizol试剂 (Invitrogen, USA) 从DRG中分离总RNA。2μg总RNA依照High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 (Applied Biosystems, USA) 合成cDNA。按照说明书, 使用特异性引物、SYBR Green I试剂和RT-PCR试剂盒, 在Bio-Rad i Q5定量PCR系统 (Takara, 中国) 上检测mRNA转录物的水平。相对表达水平通过2-DΔCt方法计算。采用内参基因GAPDH定量靶基因。采用Primer-BLAST在线引物设计软件设计引物, 引物设计见表1。表1 引物设计1.5 统计学分析采用SPSS 19.0软件对比分析, 所有数据以 (±s) 表示。Sham组和CCI组PWT、c-PWL和hPWL在个时间点的对比采用t检验。突触可塑性指标以及轴突运输指标采用方差分析进行多组间比较, LSD多重比较。以P2 结果2.1 CCI对痛觉过敏的影响图1A和图1C显示, 术前1 d, 两组间PWT和h-PWL均无显着差异。从术后1 d开始至术后14 d, CCI组大鼠的PWT和h-PWL均随时间的增加而逐渐降低, 且在每个时间点上与Sham组相比, 差异均有统计学意义 (P图1B显示, 术前1 d, 两组间c-PWL差异无统计学意义。从术后1 d开始至术后14 d, CCI组大鼠的c-PWL随时间的增加而逐渐增加, 且在每个时间点上与Sham组相比, 差异均有统计学意义 (P2.2 CCI对突触可塑性的影响图2A和图2B显示, 与Sham-14 d组相比, CCI术后14 d DRG中GAP-43和NCAM1的表达增加 (P图2C和图2D显示, 与Sham-14 d组相比, CCI术后14 d DRG中PSD-95和Syp的表达均降低 (P2.3 CCI对轴突运输的影响图3显示, 与Sham-14 d组相比, CCI术后14 d DRG中kinesin和dynein的表达均降低 (P3 讨论本研究旨在从突触可塑性和轴突运输两方面探讨大鼠坐骨神经CCI后的神经机制。有研究3报道, CCI诱导的坐骨神经损伤导致神经形态学和生理学显着改变, 此作用在神经损伤后约2周观察到最大效应。因此, 本研究评价在CCI后21 d内痛觉过敏指标, 对冷触诱发痛的检测, 喷洒丙酮后, 大鼠的正常反应是快速退回爪子, 迅速放置在网丝上。而在神经性疼痛大鼠中, 其后爪缩回并放置在网丝上的持续时间较长, 因此通过测量缩足持续时间 (cPWL, sec) 评估后爪对丙酮的冷触诱发痛。结果显示, 坐骨神经结扎后1 d开始出现PWT和h-PWL随时间的增加而逐渐降低, 在术后14 d时到达低谷, 21 d时开始恢复。这表明坐骨神经损伤后大鼠对机械性伤害的敏感程度增强, 对热刺激的耐受降低。坐骨神经结扎后1 d开始出现PWT和h-PWL随时间的增加而逐渐降低, 在术后14 d时到达低谷, 21d时开始恢复。c-PWL在坐骨神经结扎后1 d随时间的增加而增加, 在术后14 d时到达峰值, 21 d时开始降低。这表明坐骨神经损伤后大鼠对由冷刺激诱发的疼痛的维持时间增加。研究表明, DRG可能是痛觉过敏状态中受损的器官之一, 且神经损伤可以诱导DRG中基因和蛋白质表达的改变, 导致痛觉过敏的发展9。因此, 本研究主要以DRG为研究对象, 探讨CCI后14 d和21 d DRG中突触可塑性和轴突运输指标的变化。神经生长相关蛋白GAP-43是主要存在于神经生长锥和突触前末梢的一种细胞内膜相关蛋白。蛋白激酶C可以磷酸化GAP-43的丝氨酸41 (Ser41) 位点, 磷酸化的GAP-43通过稳定肌动蛋白微丝调节神经生长、出芽以及突触重塑10。研究11表明, GAP-43 mRNA的表达在舌下神经横断后2周内达到最高峰值, 然后逐渐降低。这与本研究结果一致, 在CCI后14 d GAP-43 mRNA的表达显着增加, 而CCI后21 d显着降低, 表明CCI 2周后, 机体的损伤修复基本完成。神经纤维粘附分子NCAM1是调节突触发生、神经突生长、细胞间相互作用和突触可塑性的蛋白质12。研究表明, NCAM1参与周围神经损伤诱导激活前扣带皮层对特定突触蛋白翻转的持续增强这一过程, 且NCAM1介导脊柱重组, 有助于行为敏化。周围神经结扎后, 突触后密度部分的NCAM1水平显着增强13。本研究显示, 在CCI后14 d NCAM1 mRNA的表达显着增加, 而此时痛觉过敏症状亦最为显着, 而CCI后21 d NCAM1 mRNA表达显着降低。突触可塑性的中心为兴奋性突触, 而兴奋性突触的突触后位点是由突触后致密蛋白 (PSD) 附着于突触后膜上形成的14,15。研究16表明, 海马神经元中PSD-95的过表达可促进突触成熟, 特别是谷氨酸能突触的成熟。本研究显示, 在CCI后14 d PSD-95 mRNA的表达显着降低, 表明由于坐骨神经的损伤, 在损伤后14 d只有少量PSD-95附着于突触后膜, 传递兴奋。而CCI后21 d PSD-95 mRNA表达显着增加, 提示神经损伤修复增加, 大量PSD-95附着于突触后膜, 形成兴奋性突触的突触后位点, 传递兴奋。Syp是一种钙结合糖蛋白, 作为含有神经递质的突触前小泡的整体跨膜蛋白组分被发现17, 其主要参与突触小泡融合和神经递质释放过程, 已被广泛认为是突触密度的标记18。研究19表明, 在坐骨神经CCI后, Syp蛋白的表达峰值出现在损伤后14 d, 有趣的是, 本研究结果显示, CCI后14 d Syp mRNA的表达显着降低, 而CCI后21 d显着增加, 表明CCI 14 d内突触小泡的融合以及神经递质的释放等神经信息传递过程受到损伤, 而14 d后, 此过程逐渐恢复。因此, 关于CCI后Syp表达随时间的变化, 还有待进一步详细研究。轴浆运输的发生有赖于马达蛋白中的驱动蛋白 (kinesin) 和动力蛋白 (dynein) 水解ATP所产生的能量20。Kinesin将营养物质和dynein从胞体运输到受损的轴突远端 (顺向流动) , dynein到达轴突远端后, 再直接或者间接和营养物质结合, 将营养物质运输至胞体 (逆向流动) 21。本研究结果显示, CCI后14 d kinesin和dynein mRNA的表达显着降低, 表明在坐骨神经损伤后14 d内, 轴突运输发生障碍。在CCI 14 d内, 由于神经生长相关的蛋白如GAP-43和NCAM1的增加, 修复受损的神经元, 为轴突运输和突触传递提供结构基础。但由于突触小泡蛋白Syp以及突触后膜致密部位蛋白PSD-95在CCI后14 d内的降低, 表明此时突触后膜的结构还不够完善, 突触小泡的融合以及神经递质的释放还存在障碍, 导致不能传递兴奋。这些可能是由于此时kinesin和dynein蛋白表达降低, 没有足够的营养物质, 因此不足以维持神经元重塑的能量消耗。而CCI后21 d kinesin和dynein mRNA表达增加, 同时Syp和PSD-95的表达亦增加, 表明该时神经元重塑已启动, 而神经元结构的修复已接近尾声, 因此GAP-43和NCAM1的表达降低。总之, 本研究表明CCI后14 d, 大鼠的机械性痛觉过敏、冷触诱发痛以及热痛觉过敏达到最大效应, 14 d后开始缓解。GAP-43和NCAM1在CCI后14 d内显着增加, 损伤14 d后降低, 而Syp、PSD-95、kinesin和dynein在CCI后14 d内显着降低, 损伤14 d后增加。这提示坐骨神经损伤14 d内, 主要以修复神经元结构为主。而损伤14 d后, 突触小泡的融合、神经递质的释放、兴奋的传递以及轴突运输启动, 而此时神经元结构的修复已接近尾声。参考文献：1 Jaggi AS, Jain V, Singh N. Animal models of neuropathic painJ.Fundam Clin Pharmacol, 2011, 25 (1) :1-28.2 Colloca L, Ludman T, Bouhassira D, et al. Neuropathic painJ.Nat Rev Dis Primers, 2017, 3:17002.3 Bennett GJ, Xie YK. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in manJ. Pain, 1988, 33 (1) :87-107.4 Jaken RJ, Joosten EA, Knuwer M, et al. Synaptic plasticity in the substantia gelatinosa in a model of chronic neuropathic painJ.Neurosci Lett, 2010, 469 (1) :30-33.5 Dilley A, Richards N, Pulman KG, et al. Disruption of fast axonal transport in the rat induces behavioral changes consistent with neuropathic painJ. J Pain, 2013, 14 (11) :1437-1449.6 Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat pawJ. J Neurosci Methods, 1994, 53 (1) :55-63.7 Choi Y, Yoon YW, Na HS, et al. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic painJ. Pain, 1994, 59 (3) :369-376.8 Jain V, Jaggi AS, Singh N. Ameliorative potential of rosiglitazone in tibial and sural nerve transection-induced painful neuropathy in ratsJ. Pharmacol Res, 2009, 59 (6) :385-392.9 Chen WH, Chang YT, Chen YC, et al. Spinal PKC/ERK signal pathway mediates hyperalgesia primingJ. Pain, 2018.Epub ahead of print.10 Benowitz LI, Routtenberg A. GAP-43:an intrinsic determinant of neuronal development and plasticityJ. Trends Neurosci, 1997, 20 (2) :84-91.11 Yao GL, Kiyama H. Dexamethasone enhances level of GAP-43 mRNA after nerve injury and facilitates re-projection of the hypoglossal nerveJ. Brain Res Mol Brain Res, 1995, 32 (2) :308-312.12 Dallerac G, Rampon C, Doyere V. NCAM function in the adult brain:lessons from mimetic peptides and therapeutic potentialJ.Neurochem Res, 2013, 38 (6) :1163-1173.13 Ko HG, Choi JH, Park DI, et al. Rapid Turnover of Cortical NCAM1 Regulates Synaptic Reorganization after Peripheral Nerve InjuryJ. Cell Rep, 2018, 22 (3) :748-759.14 Konno D, Ko JA, Usui S, et al. The postsynaptic density and dendritic raft localization of PSD-Zip70, which contains an N-myristoylation sequence and leucine-zipper motifsJ. J Cell Sci, 2002, 115 (23) :4695-4706.15唐玲, 唐荣伟, 唐晶, 等.突触可塑性与学习记忆关系的研究进展J.川北医学院学报, 2012, 27 (1) :89-92.16 El-Husseini AE, Craven SE, Chetkovich DM, et al. Dual palmitoylation of PSD-95 mediates its vesiculotubular sorting, postsynaptic targeting, and ion channel clusteringJ. J Cell Biol, 2000, 148 (1) :159-172.17 Wiedenmann B, Franke WW. Identification and localization of synaptophysin, an integral membrane glycoprotein of Mr 38, 000 characteristic of presynaptic vesiclesJ. Cell, 1985, 41 (3) :1017-1028.18 Eastwood SL, Burnet PW, Mc Donald B, et al. Synaptophysin gene expression in human brain:a quantitative in situ hybridization and immunocytochemical studyJ. Neuroscience, 1994, 59 (4) :881-892.19 Chou AK, Muhammad R, Huang SM, et al. Altered synaptophysin expression in the rat spinal cord after chronic constriction injury of sciatic nerveJ. Neurosci Lett, 2002, 333 (3) :155-158.20 Caleo M. Different rates of horseradish peroxidase transport in the optic nerve of neonatal and adult ratsJ. Neuroscience, 1996, 72 (3) :725-730.21 Qian JJ, Cheng YB, Yang YP, et al. Differential effects of overexpression of wild-type and mutant human alpha-synuclein on MPP induced neurotoxicity in PC12 cellsJ. Neurosci Lett, 2008, 435 (2) :142-146.