生物分子弱相互作用荧光光谱法研究.docx

生物分子弱相互作用荧光光谱法研究蛋白质的结构和生物功能的关系及生物分子的弱相互作用是人们普遍关注的课题，而其中许多生物化学过程都涉及到蛋白质间或蛋白质与其他分子的非共价键作用，如药物分子与靶点蛋白质的结合、抗原与抗体的结合以及酶与底物的结合等1-4。金属离子与核酸、氨基酸、蛋白质等生物大分子的作用以及对神经系统不正常的影响可以直接或间接地损伤 DNA，从而引起细胞的变异；但另一方面，金属配合物又可以用于诊断和治疗疾病，已经被广泛用于临床治疗癌症的药物顺铂(cis-diamminedichloroplatinum()就是一种以二价铂为中心的配合物。它们之间这种相互协同又相互制约的关系，引起了众多化学家、生物学家和医学家的广泛兴趣5。内源荧光法是基于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸，能吸收270300 nm 的紫外光而发出荧光的原理发展起来的。当测定体系中加入小分子配体时，配体与蛋白质发生弱相互作用，会导致蛋白质荧光的静态淬灭。利用这一现象，可确定蛋白质与配体的作用类型及其结合部位等6-7。荧光光谱法比紫外分光光度法灵敏，且来自核酸和其他小分子化合物的干扰也比较小。虽然荧光光谱法不像 X-ray 及 NMR 技术那样可以准确的提供结构信息，但在配体与蛋白质形成的非共价复合物晶体结构尚未知道以前，运用此方法却可以推测它们之间的弱相互作用，并且，有一些参数不能从晶体结构中得到，只有在水溶液环境中才能测得8-9。1 金属及其配合物与蛋白质的作用金属离子不仅影响金属蛋白的空间结构，还与生物大分子的识别、自组装等性质和生物功能密切相关。在许多天然和合成的金属蛋白中，配位作用能改变金属结合部位周围的肽链构象。如Cu2+与半乳糖氧化酶前体结合导致肽链变构，从而产生成熟酶10。FeMo辅因子(Mo-7Fe-9S簇)的插入使固氮酶MoFe蛋白的构象发生根本重排，并形成一个含FeMo辅因子的核心模体11-12。另一方面，金属离子存在时许多金属蛋白可以体外折叠成具有天然构象的全功能蛋白，而不需要催化剂和折叠伴侣13。金属结合部位周围的肽链构象的保守性是金属蛋白的最重要结构特征之一。如钙结合蛋白中，与Ca2+离子结合的肽段都具有规则的螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)结构，通常称为EF-hand。而"EF-hand"在脱去Ca2+离子之后都会失去原有的规则结构14。Fujita Y等在进行蛋白质定量的同时，研究了溶液中金属配合物的存在状态及其与蛋白质之间的作用，并对反应的机理进行了初步的探讨。其中PR-Mo(VI)络合物探针法比较成熟，已广泛应用于临床学上检测尿蛋白和脑脊液中的微量蛋白15。2 生物分子弱相互作用荧光光谱法研究用荧光光谱法进行生物分子的弱相互作用研究，大多数是根据Stern-Volmer方程16，即F0/F=1+KqQ，式中F0是不加猝灭剂时体系的荧光强度，F是加入猝灭剂时体系的荧光强度，Kq是猝灭常数，Q是猝灭剂浓度。根据经典的荧光猝灭理论，无论动态猝灭或静态猝灭，F0/F对Q作图将得到直线且与温度有关17。由于动态猝灭起因于扩散运动，所以随温度的升高荧光猝灭会更严重，荧光猝灭常数应增大。相反，静态猝灭是由于荧光物质与猝灭剂形成了复合物，温度升高降低了复合物的稳定性，所以随温度升高静态猝灭应减弱，荧光猝灭常数应减小。郭玉华等用荧光光谱法研究了7-羟基黄酮及磷酰化7-羟基黄酮与DNA的弱相互作用18，证明7-羟基磷酰化黄酮比7-羟基黄酮对DNA更具亲和力；郑芳芳等用荧光光谱法研究了人类ARF1蛋白与GDP/ADP的弱相互作用19，发现GDP/ADP与ARF1蛋白弱相互作用的结合常数分别为0.02269和0.00771(μmol/L)-1。在刘海涛的硕士论文中，用紫外等几种方法研究了金属配合物与蛋白质的相互作用，结果表明荧光镓试剂共振散射光谱法测定微量蛋白质的分析特性优于常用的方法20。这些研究结果表明荧光光谱法在研究生物分子弱相互作用时表现出很大的优势。3 结论和展望荧光光谱技术已经成为用来描述生物分子结构和功能的重要工具，在平衡状态下测定金属配合物-蛋白质这样的受体-配体之间的弱相互作用中发挥着重要作用。本文回顾了荧光光谱法在测定金属配合物和蛋白质弱相互作用弱相互作用动力学和热力学参数时的应用。应用此方法可以得到关于金属配合物与蛋白质结合位点和构象的定量、定性信息，而且它还拥有超灵敏的检测技术以及先进的数据获得方法，所有这些都让荧光光谱法在研究受体与蛋白质的弱相互作用变得更加容易。研究金属配合物与蛋白质的弱相互作用有助于我们对潜在的药物进行有价值的筛选，与生物化学、药物化学方法结合定会带来更多的成果。参考文献：1Friess S D，Daniel J M，Hartmann R，et alInt J Mass Spectrom，2002，219：2692Daniel J M，Friess S D，Rajagopalan S，et alInt J Mass Spectrom，2002，216：13Zhang S，Van Pelt K C，Wilson B DAnal Chem，2003，75：30104Briand L，Eloit C，Nespoulous C，et alBiochemistry，2002，41：72415陈丹丹，张涛，任丽萍金属及其配合物与生物分子相互作用机理的研究进展分析科学学报，2006，22(5)：600-604