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RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的相关探讨涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔颌面部常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的24%【1】。而且腺样囊性癌具有嗜神经侵袭和肺高转移等特殊的生物学行为。腺样囊性癌对于放疗以及化疗均不敏感，目前仍以手术治疗为主。腺样囊性癌短期预后较好，但远期生存率下降明显。远处转移尤其是肺转移是此类患者的主要致死病因之一。一氧化氮（nitric oxide， NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）催化底物左旋精氨酸合成的一种具有多种生物学活性的气体分子。NOS有3种亚型，分别由不同的基因编码，即神经元型NOS（neuronal， nNOS）、诱导型NOS（inducible NOS， iNOS）和内皮型NOS（endothelial， eNOS）。其中又以iNOS是NO合成的关键酶而且与肿瘤发生发展关系最为密切，它广泛存在于人和哺乳动物的许多细胞中，而在肿瘤细胞中表达明显升高，如乳腺癌细胞、肝癌、肺腺癌细胞、腹膜癌、黑色素瘤和口腔鳞癌【2】，本实验拟通过干扰iNOS合成，研究iNOS影响腺样囊性癌的增殖能力。1 材料与方法1.1 细胞培养 腺样囊性癌细胞系高转移株（ACC-M）由中山大学附属孙逸仙医院李劲松教授馈赠。细胞培养于10%的FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37 ，5%（v/v）CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。细胞为贴壁生长0.25%的胰酶消化传代。1.2 特异性si iNOS序列 转染腺样囊性癌鳞癌细胞株iNOS-siRNA由广州赛哲生物科技公司设计并合成，经预实验选用特异性iNOS的基因序列见表1。1.3 实验方法1.3.1 基因转染 转染前一天将ACC-M分为si-1，si-2，si-3，si-NC（阴性对照）和MOCK（空白对照）五组，培养基换成不含抗生素的培养基（美国hyclone）；转染当天，细胞汇合率达到70%以上；吸去旧的培养基，用PBS轻洗2次，每孔加入1.6 ml无血清培养基，置于5%CO2、37 培养箱中；取浓度为20 &mu;m的siRNA/microRNA2 &mu;l，加入400 &mu;l无血清培养基中，混匀后，加入4 &mu;l Turbofect siRNA transfection reagent，混匀后在室温下孵育1520 min。每孔加入上述孵育好的转染复合液400 &mu;l，置于5%CO2、37 培养箱中培养46 h后换成正常的完全培养基。转染后2448 h，检测RNA表达水平。1.3.2 实时荧光定量PCR检测 iNOS引物的设计见表2。TRIzol法提取细胞株中总的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反转录试剂盒（Promega）。将合成的cDNA 2 &mu;l加入25 &mu;l反应体系中，在荧光实时定量PCR仪上检测。25 &mu;l反应体系中包括：10xPCR缓冲液2.5 &mu;l，MgCl2 0.75 &mu;l，2 &mu;l 10 mmol/L的dNTPs，1 &mu;l 10 mmol/L的iNOS和VEGF的上下游引物，0.25 &mu;l 5 U/&mu;l的Taq DNA聚合酶，双蒸水17.5 &mu;l。PCR反应条件：预变性95 ，15 s；变性95 ，5 s；退火延伸60 ，30 s，共45个循环。1.3.3 MTT法检测细胞增殖活性 在96孔板中接种细胞（5000个/孔），每孔100 &mu;l。将96孔板放在培养箱中培养（37，5%CO2）。24 h后使用turbofect siRNA transfection进行转染。转染24 h、48 h、72 h后向每孔加入10 &mu;l的CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1.5 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光值。1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，组间进行单因素的LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 RT-qPCR检测结果 ACC-M胞中基因的qPCR产物，在转染后实验si-1组与si-2，si-3，si-NC（阴性对照）和MOCK（空白对照）五组iNOS表达比较差异有统计学意义（P<0.05），实验数据的设定见图1。2.2 iNOS表达下调能够有效抑制腺样囊性癌细胞的增殖活性 根据以上结果选取si-1组进行细胞增殖活性实验。利用iNOS的siRNA对ACC-M细胞中iNOS的表达进行抑制，利用MTT法检测ACC-M细胞的增殖活性。结果显示：在ACC-M细胞中抑制iNOS的表达48 h和72 h时实验组的细胞增殖活性明显受到抑制，与24 h比较差异有统计学意义（P<0.05）。细胞增殖活性的变化见图2。3 讨论NO既具有第二信使和神经递质的功能，又是杀伤肿瘤细胞的效应分子，在肿瘤的发生发展中具有杀伤和促进肿瘤生长的"双刃剑"作用。一般认为如果肿瘤体积在小于12 mm3时候没有新生的毛细血管和小血管长入，肿瘤就会发生消退，Thomesen等【3】曾经报道，在乳腺癌、胃癌中，iNOS催化产生低水平的NO（比引起瘤细胞死亡的浓度低12数量级），为肿瘤发展创造有利的微环境。因此在肿瘤微血管的形成过程中，iNOS可能起着促血管生成的作用。从而促进了肿瘤的发生发展。而且现在已经知道的很多肿瘤组织都有iNOS蛋白的表达【4】。在笔者以往的研究中发现iNOS在腺样囊性癌中存在着高表达，因此在本实验中在利用ACC-M细胞株沉默了iNOS后检测到ACC-M增殖活性降低。这印证了iNOS可以调控ACC-M的生长是潜在的靶基因。但iNOS通过什么机制调控肿瘤的发生发展？以往的研究表明，Gallo等【5】发现在头颈肿瘤中诱导型NOS与微血管密度（microvessel density，MVD）的表达成正相关，提示iNOS可以诱导癌组织中NO的形成，从而促进肿瘤的侵袭生长。Jenkins【6】将iNOS基因转染到人结肠腺癌细胞株中使其产生NO，成为iNOS-19细胞克隆。在裸鼠体内iNOS-19肿瘤快速生长，在iNOS-19肿瘤中出现较多的新生血管。本研究通过下调iNOS的表达抑制腺样囊性癌细胞株的增殖能力。揭示了iNOS调表达影响腺样囊性癌增殖的关系，针对iNOS信号通路进行深入研究，对帮助解决iNOS恶性肿瘤基因治疗效果不佳的问题及肿瘤的基因治疗产生一定的影响。参考文献【1】马大权.涎腺腺疾病.北京：人民卫生出版社，2002：211-239.【2】 Brennan P A，Palacios-Callender M，Umar T， et al.Expression of type 2 nitric oxide synthase and p21 in oral squamous cell carcinoma.Int J Oral Maxillofac Surg，2002，31（12）：200-205.【3】 Thomesen L L，Miles D W. Role of nitricoxide in tumor progression： lesions fromhumantumors. Cancer Metastasis Rev， 1998，17（4）：107-118.【4】 Ellie E，Loiseau H，Lafond F， et al. Differential expressionof inducible nitric oxide synthase mRNA in human braitumours.Neuroreport，1995，7（1）：294-296.【5】 Gallo O，Masini E，Morbidelli L，et al. Roles of nitric oxidin angiogenesis and tumor progressionin head and neck cancer.J Nati Cancer Inst，1998，90（8）：541-549.【6】 Jenkins D C，Charles I G，Thomsen L L， et al.Roles of nitric oxidein tumor rowth.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（10）：4392-396.