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微 生 物 工 程 实验指导 曾 松 荣、柯 野 编 韶关学院 英东生命科学学院 （适用专业：10级本科生物技术） 重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定 一、实验目的 1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。 2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。 3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。 二、实验内容 1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。 2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。 3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。 4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。 5、SDS-PAGE鉴定重组蛋白酶。 三、实验原理 蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应等方面具有重要的作用。蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量60%以上；广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源不稳定。动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。动物来源蛋白酶生产成本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。因此，动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。据统计，微生物蛋白酶占据了世界蛋白酶销售大约 70%以上的份额。 目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真菌的极少。目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体)发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生长状态)影响。并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了其进一步的开发利用。因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。 毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表达量高。该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白，该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。 四、器材与试剂 1、菌种：重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。 2、培养基 BMGY培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500生物素溶液（410-5%生物素）2.0 mL，甘油 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。 BMMY 培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g，YNB 13.4g，500生物素溶液（410-5%生物素）2.0 mL，甲醇 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL。 3、试剂 福林试剂(Folin试剂)：于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O) 100g，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O) 25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗(No4-5)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na2CO3) 42.4g，定容至1000mL。 0.4mol三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸(CCL3COOH) 65.4g，定容至1000mL。 pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O) 31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol溶液(B液)。取A 液28mL 和B 液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 100g/mL酪氨酸溶液：精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000g/mL，再吸取此液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，即配成100g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 电极缓冲液（pH 8.3）：0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）， 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）：称3.02 gTris、14.42 g甘氨酸，1g SDS，用蒸馏水定容至1000ml。 分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5 mol/L Tris-HCl 称18.171 gTris，80 ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 8.8，蒸馏水定容至100ml。 浓缩胶缓冲液（pH6.8）：0.5 mol/L Tris-HCl 称6.075 gTris，80ml蒸馏水溶解，用浓HCl调pH 6.8，蒸馏水定容至100ml。 凝胶：30%丙稀酰胺（Acr）、1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis） 称30 gAcr、0.8 g Bis，加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至100 ml。 染色液：称2.5 g考马斯亮兰R-250，加500 ml甲醇，100 ml醋酸, 用蒸馏水定容至1000 ml。 脱色液：取250 ml甲醇，70 ml醋酸，用蒸馏水定容至1000ml 样品缓冲液：取10% SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6 ml，甘油1.5ml，0.05%溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至10 ml。 样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml，煮沸5min。 10% SDS：称10.0 g SDS，用蒸馏水定容至100 ml。 4、器材 分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、pH计、离心机、电子天平、电泳槽等。 五、实验操作 （一）配制BMGY和BMMY培养基 1 称量：按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 2溶解：向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。 3.调节pH值：用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH，本实验采用的是缓冲液配制培养基，也需要培养基的最终pH。 4.分装及包扎：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。 6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121 灭菌20分钟。 （高压蒸汽灭菌器使用方法：加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3)，开始计时，维持15-30min。灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。） 7.灭菌后验证灭菌是否彻底：将培养基放置于37培养箱中，培养48 h，检测是否有菌生长。 （二）重组毕赤酵母生长曲线测定 1、种子液制备 取重组毕赤酵母工程菌株斜面菌株1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入BMGY培养液中，250rpm，30振荡培养24 h。 2、接种培养 用5ml无菌吸管，准确地吸取5ml重组毕赤酵母工程菌株的培养液，接种到灭菌装有50ml BMGY培养液的250ml的三角瓶中，接种后振荡，使菌体混匀。 3、培养 将接种后三角瓶放置于摇床上，250rpm，30振荡培养。分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30小时从三角瓶中取出一定体积的菌悬液，立即放4冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。 4、比浊测定 以未接种的BMGY培养液作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的BMGY培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1-0.65以内，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。 （三）重组毕赤酵母的诱导表达 1、取出冰箱中保存的重组毕赤酵母工程菌株，接种于含25mL BMGY 培养基的 250mL 摇瓶中，28-30振荡培养（250300rpm）至对数生长期OD600达 2-6，约 16-18h）。 2、室温下以 3000 g 离心 5min 回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY 培养基中，至 OD600值为 1.0-2.0（约 100-200mL）。 3、将培养液置于 1L 摇瓶中，覆盖两层无菌纱布和一层灭过菌的报纸，置摇床中，2830继续培养并开始诱导表达（注意诱导温度应严格控制，不要超过 30）。 4、诱导表达起始后，每隔 12h 补加 100%甲醇至终浓度为 0.5%2%以维持诱导。 5、诱导开始后，每隔 24h 取样一次，直至 168h。每次取诱导培养液 1mL 于 1.5mL离心管中，室温下以最大转速离心 2-3min，将上清液和细胞沉淀分别冻存于-20。 （四）发酵液酶活的测定 1、 标准曲线的绘制 1.1、按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 试剂管号123456蒸馏水，mL 10 8 6 4 2 0 100g/mL酪氨酸，mL 0 2 4 6 8 10 酪氨酸最终浓度，g/ml 0 20 40 60 80 100 1.2、 测定步骤 取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4 mol碳酸钠5 mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20min在721型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次，取平均值。将1-6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。 2、发酵液的稀释液 取一定量的发酵液，加入pH7.2磷酸盐缓冲液稀释为2倍、4倍、8倍和10倍的稀释液。 3、样品测定 取15100mm试管3支，编号1、2、3(做2只也可)，每管内加入样品稀释液1mL，置于40水浴中预热2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心1000rpm、10 min，然后另取15150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL，摇匀，40保温发色20min后进行光密度(OD)测定。 空白试验也取试管3支，编号(1)、(2)、(3)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。 样品的平均光密度(OD)-空白的平均光密度(OD)=净OD值。 4、计算 在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。 发酵液的蛋白酶活力单位= 式中： A-由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值K)；4-4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍)；N-酶液稀释的倍数；10-反应10min。 （五）SDS-PAGE鉴定重组蛋白酶 1、安装垂直平板电泳槽。 2、灌制分离胶 在100ml烧杯中依次加入重蒸水3.35ml，1.5mol/LT ris-HCl (pH8.8)缓冲液2.5ml ，10%SDS 0.1 ml，凝胶贮备液4.0 ml， 10%过硫酸铵50l和TEMED 5l，由于加入TEMED后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层异丙醇，将电泳槽垂直静置于室温下约30min，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的异丙醇，尽可能去干净。 3、制备浓缩胶 一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水3.4 ml，0.5mol/l Tris-HCl缓冲液（pH6.8）0.63 ml、10% SDS 50ul、凝胶贮备液（Acr/Bis）0.83 ml，10 %过硫酸铵50l、TEMED 5l，在100ml烧杯中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合9。 4、样品的制备 标准蛋白样品的制备：取出一管预先分装好的20 l低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热5min，取出冷至室温，高速离心1min。 待测样品的制备：取发酵液1000 l于1.5 ml离心管中，加入600 l无水乙醇,然后放进冰箱冰浴25 min，取出来10000 rpm离心5 min，弃上清，重新加入300 l菌液及600 l无水乙醇，放进冰箱冰浴25 min，取出来10000 rpm离心5 min，弃上清，加入已配置好的溴酚蓝,搅拌均匀，沸水浴中加热5 min，取出冷至室温，高速离心1 min。 5、电泳 待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液，去除电泳槽内的所有气泡。用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。接上电泳仪，打开电泳仪电源开关，调节电流至20-30mA并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1 cm时，停止电泳。 6、染色与脱色 小心将胶取出，置于一大培养皿中，加染色液染色1h，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。 7、照相 六、作业与思考题 1、配制的培养基有无污染，应该怎样处理污染的培养基？ 2、绘制出重组毕赤酵母工程菌株的生长曲线图。 3、发酵液的酶活是多少？ 4、影响SDS-PAGE电泳实验的误差可能原因是什么?根据你的实验进行分析。 5、写出完整的实验报告。