凝胶过滤中的脱盐柱的使用.ppt

凝胶过滤中脱盐柱的应用,廖红军,凝胶过滤（分子筛）层析概述,是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小分离混合分子的技术； 凝胶过滤主要可以用在两个领域：1、组群分离，根据大小的范围将样品的成分分成两个主要组群，主要应用于除去样品中高分子量或低分子量污染物（如细胞培养液中酚红）、脱盐或更换Buffer；2、生物分子高分辨组分的收集（根据生物分子的分子量差距进行分离）；,凝胶过滤分离原理：空间排阻,常用于脱盐的介质,Sephadex G-10，非常适合于分离生物分子，如从小分子（分子量大于100）中分离肽段（分子量大于700）； Sephadex G-25，主要用于球蛋白组群分离，尤其适合分子量大于5kd的脱盐或其他小分子污染物的去除； Sephadex G-50，适合从小分子（1.5kd）中分离大分子（30kd）物质。,材料特性,Sephadex是由3-氯-1，2-环氧丙烷(epichlorohydrin) 和葡聚糖交联加工成珠状的介质。下图是Sephadex的部分结构：,交联度不同产生了不同的Sephadex填料，影响了他们的溶胀程度和对特定分子大小的选择性,脱盐柱的一些参数,处理量：30%总柱体积； 样品浓度一般不超过70mg/ml，粘度过大，粘度的变化与温度有关； 柱高：10cm；,优点,一般生物大分子的分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、可靠； 层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程、产品的纯度和回收率，又可以连续自动进样和收集，自动化程度高，容易放大； 运行周期短，大多数蛋白回收率95%；,化学稳定性,Sephadex在所有常用的缓冲体系中稳定，以及添加剂，如离子和非离子去污剂、变性剂（8M尿素或6M盐酸胍）； 在短链醇类中稳定，如乙醇、甲醇、丙醇，但是超过25%浓度不经常使用； 注意： Sephadex在醇类中填料会收缩； 一般保存在425 20%乙醇中，不要冰冻，或者0.01M NaOH中， NaOH是抑菌的，该溶液非常好去除，而且填料不会收缩。,选择脱盐介质要考虑的因素,选择脱盐介质要考虑的因素,Sephadex G-25有粗、中、细、超细四种不同颗粒大小可选择； 颗粒越小分辨率越高，但流速也越慢； 样品在粒径粗的介质中更容易扩散，所以 SephadexG-25 Coarse (粗) 的上样量在四种介质中最少； 粗颗粒介质流速快，Sephadex G-25 Coarse 在每个单位时间、单位柱床体积所纯化的产品，即生产率最高； 选择最合适的脱盐介质，主要是要达到分辨率与生产率的最佳结合。,应用,脱盐、缓冲液置换。传统实验室样品脱盐常用透析方法时间长、缓冲液消耗量大，又容易损失宝贵的样品； 保护亲合层析洗脱样品，亲合层析有时会用较剧烈的洗脱条件，时间一长，洗脱的目标蛋白便失去活性，若在洗脱时串联一根脱盐柱，可以将目标蛋白快速置换到稳定缓冲液中； 其它实验室常规工作应用： 1. 亲合层析洗脱液中所含的在紫外有强烈吸收的小分子会干扰往后的检测工作。如组氨酸融合蛋白，需用咪唑从螯合了镍离子的层析介质上洗脱，Sephadex G-25可以将咪唑去除。 2. 在生物分子偶联反应中去除小分子反应副产物。 3. 终止酶反应，去除小分子辅助因子、抑制剂等。 4. 从标记生物分子中去除游离的同位素标记，如I125。 5. 在进行阴离子交换层析前，从培养基中去除苯酚红。,大规模生产应用,不同生产规模的天然生物制品及基因工程产品生产工艺中使用Sephadex G-25介质的例子有很多。 包括植物中抽提的过敏源蛋白、血浆蛋白、奶中的乳清蛋白、交细胞培养单抗、重组过氧化物歧化酶、重组肿瘤坏死因子、基因工程乙肝疫苗等。 所处理的样品体积由数百毫升至近千升不等。,