MTT原理方法及操作步骤[教学试题].doc
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3: 5%CO2，37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）2: 置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度。(2) 避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定(6) 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。转MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后4避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4避光保存，在两周内用完。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。4：比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。药物MTT法实验步骤贴壁细胞：（我的主要操作是贴壁细胞）1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2: 5%CO2，37孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。3: 5%CO2，37孵育24-72小时，倒置显微镜下观察。4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm（570nm)处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔即空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。悬浮细胞：1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1106/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；需检测物10ul；细胞悬液50ul（即5104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）。2: 置37，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度。每孔1000-10000个，但是也要看细胞种类和状态。我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖，铺过2000至8000个每孔。2000太低，8000过高，对于阴性组高于5000个吸光值就很大，大于1.5。所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000。一般每孔4000个细胞为宜(2) 避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。（阴性组在0.8-1.2，加药组在0-0.7.）(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO。加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定(6) MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。(7) 铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致，一般每加几孔就混匀一下。我一般是加完一排复孔就混匀一次6教学#材料
