质粒抽提技术.ppt
质粒DNA的提取和纯化,基因工程,移液器和EP管,质 粒,质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般不整合到宿主染色体上。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术中重要的工具。,分类: 单拷贝质粒; 多拷贝质粒; 紧密控制型; 松弛控制型;,质粒DNA的提取方法,碱裂解法; 煮沸裂解法; 酚氯仿抽提法;,概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。,基本思路,培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细菌; 分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA,根据实验所需) 电泳检测;,碱裂解法的基本原理,十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。 经SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA和蛋白质变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开。 当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。,实验步骤,1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5ml LB培养液倒入1.5mleppendorf管中,4下4000rpm离心5min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡)。 4、加入新配制的溶液200l,盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴2分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口,颠倒混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心10分钟。 6、上清液(450uL)移入干净eppendorf管中,加入等体积的饱和酚(1:1),充分颠倒混匀,4下12000g离心10分钟。,7、将水相(400uL)移入干净eppendorf管中,加入等体积酚/氯仿,颠倒混匀,12000rpm离心10min。 8、将水相(350uL)移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟,然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于10l TE缓冲液(pH8.0,含20g/ml RNaseA)中,储于-20冰箱中。,LB液体培养基(Luria-Bertani),称取蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。,溶液I,50mmol/L葡萄糖,25mmol/ L T r i s. Cl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱,溶液I:重悬细菌; 葡萄糖:比重大,使细菌不易沉淀; TrisHCl:缓冲体系; EDTA:螯合金属离子;,溶液,1mol/L NaOH 200l 10% SDS 100 l H2O 700 l,溶液II破膜,变性基因组DNA和蛋白质; SDS破膜作用,解聚核蛋白并与蛋白质 分子结合使之变性 ; NaOH(pH12),破坏氢键,变性基因组DNA;,溶液,5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.5ml,H2O 28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac5mol/L。,溶液III中和溶液,复性质粒DNA;,酚/氯仿(1:1),酚变性蛋白质; 氯仿萃取溶液中的酚;,分为两层,上层为水层,下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。,乙醇,无水乙醇(2倍体积)沉淀质粒DNA; 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,除去沉淀中的盐分;,琼脂糖凝胶,从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后,剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分,结构是链状的聚半乳糖,易溶于沸水,冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛,常用于凝胶层析和电泳。,电泳,6loading buffer 2ml 样品 10ml Marker 10ml 120V, 电泳30min, 电泳结束,紫外灯下观察结果,混匀,上样,混匀,上样,BM 5000 DNA Marker,电泳鉴定,其中超螺旋结构泳动最快; 其次为线性结构; 最慢的可能是复制中间体(没有复制完的两个质粒连在一起);,