第八章基因工程疫苗.ppt

1,第八章 基因工程疫苗,2,疫苗与基因工程疫苗 传统疫苗（Traditional Vaccine）用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂或者用理化方法将病原微生物杀死制备的生物制剂，用于人工自动免疫以保护人或动物产生免疫力，这些制剂被称为疫苗（多用于预防），即疫苗是由病原体制成的。,3,国内常将细菌制作的人工主动免疫生物制品称为菌苗。将病毒（Virus）、立克次氏体（Rickettia）、螺旋体（Spiral coil）等微生物制成的生物制品称为疫苗。 现在国际上一般将细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素统称为疫苗 （vaccine）。,4,基因工程疫苗：上述狭义的疫苗被称做传统疫苗（traditional vaccine），即完整的病原体为主制成的疫苗；而基因工程疫苗则属于新一代疫苗（New generation Vaccine）或高技术疫苗范畴（High-tech Vaccine）。 主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，广义的还包括遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等。,5,现代疫苗（Modern vaccine ）：是一种利用现代分子生物学技术使用Ag通过诱发机体产生特异性免疫反应以予防和治疗疾病或达到某种特定的医学目的生物制剂。,6,1、理想疫苗的条件 高度有效、绝对安全、产生免疫快、适用于各种人群、可大量生产、方便贮存和运输、价格合理。 2、基因工程疫苗研制的特点 相对于传统疫苗而言，基因工程疫苗的研制需要明确病原体的保护性抗原； 基因工程疫苗的构建需要特定的载体与表达系统，载体与表达系统既要能够高效表达外源基因，又要保证基因工程疫苗的安全性。 在基因工程疫苗的研制中，保护性抗原（基因）的选择、载体与表达系统的选择是关键性因素。佐剂的选择、免疫途径、免疫部位、免疫时间及次数的选择，也是保证疫苗效力的必不可少的环节。,7,一、基因工程亚单位疫苗(gene engineering subunit vaccine) 1、概述 基因工程亚单位疫苗，主要是指将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的疫苗。 优点： 产量高； 纯度高； 安全性高 ； 用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。,8,缺点： 与传统亚单位疫苗相比 ，免疫效果较差。 增强其免疫原性的方法： 调整基因组合使之表达成颗粒性结构 是在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球 加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。,9,2、基因工程亚单位疫苗的设计策略 2.1抗原的选择 保护性抗原成分的选择是疫苗设计中最为关键的步骤。 有效的保护性抗原需满足以下标准： 有效的保护性抗原为病原体中具有免疫优势的抗原决定簇，能够有效地诱导机体产生针对该抗原的抗体，为机体防御病原体的入侵提供保护。 对人体是安全的。适量进入人体，不会致病。 特异性，针对某一病毒或其它病原体。,10,2、基因工程亚单位疫苗的设计策略 保护性抗原的选择： 一般选择病原体的结构蛋白作为抗原构建疫苗，对于易变的病毒如A型流感病毒，可选择各亚型共有的核心蛋白保守区段作为保护性抗原构建疫苗。这样可以产生跨株系的保护反应，避免易变病毒的免疫逃避问题。 一些非结构蛋白也可以作为抗原构建疫苗，如乙型脑炎病毒的NS1蛋白也有保护作用。,11,2、基因工程亚单位疫苗的设计策略 2.2 表达载体及表达系统的选择 表达载体： 质粒大肠杆菌及酵母（表达宿主） 腺病毒载体、痘苗载体、逆转录病毒载体哺乳动物细胞,12,二、基因工程载体疫苗（gene engineering vector vaccine） 1、概述 基因工程载体疫苗是指利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。 优点：疫苗多为活疫苗，重组体用量少，抗原不需纯化，载体本身可发挥佐剂效应增强免疫效果 缺点：曾感染过腺病毒或者接种过痘苗的人，对载体微生物已具有免疫力，使之接种后不易繁殖，因而影响免疫效果。,13,2、 基因工程载体疫苗的设计策略 2.1抗原的选择 2.2载体的选择 基因工程载体疫苗的作用机制是将编码保护性抗原的基因直接在体内表达，产生抗原，诱导免疫反应。非致病的细菌或病毒都可以作为疫苗载体。载体的安全性是需要考虑的首要问题。原因： A. 载体活疫苗不可避免地带有活病毒或细菌一些潜在的问题。如病毒可能在体内不断地复制其基因组并形成完整的病毒粒，在繁殖过程中有可能发生突变、自身修复、或于野生型毒株重组而发生毒力返祖，对机体构成威胁。,14,2、基因工程载体疫苗的设计策略 B. 新近形成的病毒粒可由机体排至体外，对环境造成污染，如人类已经不再接种痘苗病毒预防天花，因此使用痘苗病毒有潜在的危险。,对策：非复制型病毒。这种载体在转染细胞后仅能形成一代病毒颗粒即自行消灭，由于传代少，发生毒力返祖的可能性降低，并且子代数目少，对环境的污染程度降低，因此可以大大提高疫苗的安全性。缺点：在体内存在时间短，仅能形成一代病毒颗粒，因此保护性抗原拷贝数低，故免疫效果受到影响，需多次接种。,15,2、基因工程载体疫苗的设计策略 常用载体： （1）病毒载体 最常用的是痘苗病毒和腺病毒。 痘病毒 优点：宿主范围广，可容纳大分子外源基因，高水平表达 缺点：不能采用口服免疫途径，因此不能形成黏膜免疫。 腺病毒 优点：可经黏膜免疫的理想载体系统,16,2、基因工程载体疫苗的设计策略 常用载体： （2）细菌载体 优点：免疫全面，可诱发黏膜、细胞、体液免疫 操作简单，易于实现多种抗原的输送。 缺点：使用原核系统表达抗原，免疫原性可能受到影响。 伤寒沙门氏菌是一种肠道致病菌，其减毒菌株可用于疫苗载体，能诱导黏膜免疫。 减毒伤寒沙门氏菌 Ty21a缺失了galE基因，细菌表面的Vi抗原为阴性，而且重要抗原脂多糖的合成能力下降，为减毒菌株。 缺点：质粒不稳定，外源蛋白易降解。,17,2、基因工程载体疫苗的设计策略 常用载体： （2）细菌载体 卡介苗（BCG）经过半个多世纪的实践证明是一种安全疫苗，以诱导细胞免疫为主。 缺点：卡介苗在接种者体内可诱导很强的针对结核分枝杆菌的免疫反应，导致卡介苗被接种者免疫系统破坏，在体内存在时间短；外源基因的抗原性较弱。,18,Cell Surface Display of Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Hemagglutinin on the Surface of Pichia pastoris Cells Using a-Agglutinin for Production of Oral Vaccines Expression of proteins in yeast is fast, inexpensive, and yeast have the added benefit of providing high-quality nutrition when given in the feed. Yeast are generally regarded as safe and benign organisms and would therefore allow long-term feeding of yeast expressing recombinant proteins in order to maintain immunity over time with limited side effects. In addition to the convenience of production, components of the yeast cell wall have been shown to contain natural adjuvant activity. Therefore, the expressed recombinant proteins are more immunogenic when administered with the yeast cell wall components.,19,AGa1,甘露糖蛋白凝集素,20,21,22,23,三、基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine） 1、概述 基因缺失活疫苗使用分子生物学技术改造或去除与毒力有关株的基因，获得稳定的减毒表型的缺失突变毒株，用该突变制成的疫苗即为基因缺失活疫苗。 优点：有突变性状明确、稳定； 不易返祖、毒力恢复； 是研究安全有效的新型疫苗的重要途径。,24,2、基因缺失活疫苗的设计策略 设计关键：选择合适的靶基因。一般选择删除与毒力有关，病原微生物复制的非必需基因。为了减少发生毒力返祖的可能性，最为理想的是删除至少两个与毒力相关的基因或基因作用位点。 必须建立在对病毒的毒力相关基因有清楚的了解基础之上。目前，对病原体的基因组测序工作开展较多，为基因缺失活疫苗的研究奠定了基础。,25,核酸疫苗（nucleotide vaccine）：又称DNA疫苗（DNA vaccine），是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。,四、核酸疫苗,26,1990年，Wolff等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。,四、核酸疫苗,27,优点： 易于制备； 便于保存； 可多次免疫并且容易制成多联多价疫苗。 缺点： 外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变； 能否引起免疫病理作用，如自身抗核酸抗体的产生，免疫耐受等。,28,目前进入临床试验的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和疟疾 DNA疫苗。,四、核酸疫苗,29,由于核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。,四、核酸疫苗,30,局部注射的核酸（重组质粒DNA）被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。,1、免疫机制,四、核酸疫苗,31,目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为： “内源性抗原”：与MHC类分子结合，诱发CTL介导的细胞免疫应答。 “外源性抗原”：与MHC类分子结合，诱发偏向Th1型免疫应答。,四、核酸疫苗,32,目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体。,四、核酸疫苗,33,DNA疫苗接种后，体内仅表达pgng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。 如何解释这一现象呢？,四、核酸疫苗,34,目的基因（含载体质粒）含有CpG基序的回文序列，能激活较强的CTL效应，并能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激DNA序列。,CpG基序与IL-2、TNF-、IFN-的基因结构相似而产生协同作用。,四、核酸疫苗,35,2、构建与免疫,目的基因的选择：侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。,四、核酸疫苗,36,核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核酸免疫。,四、核酸疫苗,37,载体的选择：构建DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。,四、核酸疫苗,38,重组质粒可分为两个部分： 转录部分：由启动子、插入的目的抗原cDNA和poly A终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。 佐剂部分：CpG基序。,四、核酸疫苗,39,启动子的选择：质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。,四、核酸疫苗,40,DNA疫苗的优化 联合构建：在载体质粒中插入2个或2个以上目的抗原基因，既能激活CD8T细胞产生特异性CTL，又能激活CD4Th2细胞产生体液免疫。 协同构建：将目的基因与某种细胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果。,四、核酸疫苗,41,免疫途径、剂量、时间：常见免疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。,四、核酸疫苗,42,3、核酸疫苗与传统疫苗的比较,传统免疫所使用的抗原一般是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。 核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，可提供与天然构象极为接近的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与自然感染过程相似。,四、核酸疫苗,43,核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力。,四、核酸疫苗,44,灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，需多次接种免疫原，加强免疫。,核酸疫苗可在体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。,四、核酸疫苗,45,采用不同毒株之间的保守DNA序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，从而有效地预防病原体极易发生变异的某些疾病（如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等）。,四、核酸疫苗,46,核酸疫苗与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合，不仅能预防疾病，还可作为治疗性疫苗，治疗一些复杂难治的疾病，如病毒性肝炎、癌症等。,四、核酸疫苗,47,五、蛋白工程疫苗（protein engineering vaccine ） 蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。,48,（二）遗传重组疫苗 （genetic recombinant vaccine） 遗传重组疫苗是指使用经遗传重组方法（genetic recombination）获得的重组微生物制成的疫苗。 通常是将对人体无致病性的弱毒株与强毒株（野毒株）混合感染，弱毒株与野毒株间发生基因组片段交换造成重组，然后使用特异方法筛选出对人体不致病的但又含有野毒株强免疫原性基因片段的重组毒株。,49,（三）合成肽疫苗（Synthetic peptide vaccine） 合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。 优点：纯度和安全性高；副作用小；可长期在常温下保存； 缺点：其抗原性单一；免疫原性弱。 因此须用几种合成肽抗原联合使用，还须用多种方法提高合成肽的免疫原性。,50,（四）抗独特型抗体疫苗 （anti-idiotype vaccine） 抗独特型抗体疫苗是指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗体（ab2）做抗原制成的疫苗。 目前此疫苗尚处于理论性研究阶段。,51,（五）微胶囊可控缓释疫苗 (controllable released micro-capsule vaccine) 微胶囊可控缓释疫苗，指使用微胶囊技术将特定抗原包裹后制成的疫苗。,52,特点 小于10m的微胶囊在注射部位可被巨噬细胞吞噬并携带至淋巴结附近和免疫系统其他部位，具有更强的免疫效果。 大于30m的微胶囊，更适于做可控缓释。由于微胶囊的保护作用，母体抗体不能使抗原失活，可用于婴幼儿免疫接种。 微胶囊在肠道内不受酸或酶的影响，可用于口服。,