分子实验室、细胞实验室常用配方.docx
《分子实验室、细胞实验室常用配方.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子实验室、细胞实验室常用配方.docx(67页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、分子实验室、细胞实验室常用配 方2(一)WB 相关试剂及常用缓冲液l RIPA(100mI)(最后要调 pH为7.4)终浓度Tris-HCI(pH7.4 50m分子量 称取121.14 605.7mg)NaCITritonX-100 脱氧胆酸钠M150mM1%1%58.44876.6mg1mI1gEDTA1 mM 292.24 29.2248m8gSDSPMSF(100mM)0.1%0.1g使用时每1ml加10ull 10%过硫酸铵溶液 AP(分装保存于-20 度)AP 粉末 1gddH 0 10ml2l 10SDS(十二烷基硫酸钠):SDS 粉末 10gddH 0 定容到 100ml223注
2、意:用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡l 6X 蛋白质 sample bufferTris-HCl(1M,pH6.8)30mLSDS甘30mL10g油DTT(154.25 ) 9.3g溴酚蓝0.06gdd H 02容至 100mLl 10XPBS 缓冲液的配制:NaCl 80gKCl 2g定Na HPO2414.4g(十二水合36g)KH PO 0 2.4g2 4加 800 mLddH O,根据开始的 pH 用 NaOH 或 HCL 调2pH 到 7.4,调好 pH 再定容到 1 升。配好后用高 压蒸气灭菌后常温保存最好是在 4 度34l PBST(1X)PBS(1X) 500mlTween 20
3、 500 ll 50Tris- 乙酸(TAE)缓冲液配制 1L 溶液各 成分的用量Tris 粉末 242g冰醋酸 57.1mlNa EDTA2H O 37.2g2 2ddH 0 定容到 1L2l 封闭液脱脂奶粉 5g叠氮钠 0.02g( 现 配现用时可不加)PBS100mLl 染色液(室温)1L 500ml 200ml 100ml定容到甲醇 500mL 25010050乙酸 100502010R250 考马斯亮蓝mL0.5g 0.25 0.1 g 0.0545H 02400g200 80g40lmL脱色液:(室温)1 醇 165mL2 酸 50 mLH 0 785 mL2l 8.8Buffer
4、: (调 pH 至 8.8,4 度保存)Tris10%SDS100ml18.17g4mL200ml36.34g8mlddH 02定 容 至 200ml100mLl 6.8 Buffer: (调 pH 至 6.8,4 度保存)Tris10%SDS100ml606g4mL200ml12.12g8mlddH 02定 容 至 200ml100mL56l 转移缓冲液(10trans buffer ):(常温保 存)1L 2L甘氨酸 144g 288gTris 粉 30.3g 60.6末ddH 02定容至定容至1L 2L使用时甲醇 200mL 转移缓冲液(10) 100 mL ddH 0 700 mL2l
5、 电泳缓冲液(10)(running buffer) :(常 温保存)1L 2L甘氨酸 144g 288gTris 粉 30.3g 60.6末SDS 10g 20gddH 02定容至定容至1L 2Ll 10)TBS: (常温保存)NaCl 80.0g67Tris 粉末 24.2gddH 02定容至 1Ll TBST(1X)TBS(1X) 500mlTween 20 500 ll Stripping buffer( 可反复利用 ) 温老师组配 方10%SDS 10ml-巯基乙醇 350 lTris-HCI(pH6.8 ) 6.25ml(6.06 加到 50mL 水)加入 ddH O2至 50mL
6、l Stripping buffer( 可反复利用 ) 郭老师给配 方甘氨酸 15gSDS 1gTween20 1mldd ddH O 1L2作这个 buffer 洗 20min ,然后用 PBST 洗 3 次, 再重新封闭孵抗体。7889(二)细胞和细菌培养基、抗生素 l LB 培养基(当天灭菌后放 4 度存放)1000ml 500ml 300 ml 250 ml 200 ml氯 化 10g5g3g2.5g2g钠蛋 白 10g5g3g2.5g2g胨酵 母 5g2.5g1.5g1.25g 1g提 取物ddH 02定容至 定容至 定容 定容至 定 容1000ml 500ml至300ml250ml
7、至200mll LB 平板:(当天灭菌后倒平板,放 4 度存放)1000ml 500ml 300ml250 ml 200 ml氯 化 10g 5g3g2.5g 2g910钠蛋 白 10g胨酵 母 5g5g2.5g3g 2.5g 2g1.5g 1.25g 1g提 取物琼脂 15g 7.5g 4.5g 3.725g 3gddH 02定容至 定容至 定 容 定容至 定 容1000ml 500ml至300ml250ml至200mlSOB 培养基将下列组分溶解在 0.9L 水中:蛋白胨20g酵母提取物 5g氯0.5g化钠1mol/L2.5ml氯 化 钾用水补足体积到 1L。分成 100ml 的小份,高压
8、 灭菌。培养基冷却到室温后,再在每 100ml 的小1011份中加 1ml 灭过菌的 1mol/L 氯化镁l 1M IPTG(异丙基硫代 -D- 半乳糖苷(分子 量为 238.3 )溶液IPTG 粉末 2.383gddH 0 定容到 10ml用 0.22m 滤器过滤2 除菌,分装成 1ml 小份贮存 于-20。l Amp+(50mg/ml)Amp+粉末 50mgddH 0 1ml注意:分装保存于-20 度,使用时按 1000 :1 的 比例用l Kana+(50mg/ml)Kana + 粉末 50mgddH20 1ml注意:分装保存于-20 度,使用时按 1000 :1 的 比例用l 胰酶:抽
9、滤,长期保存可放负 20 度粉末 0.25gEDTA 0.02-0.03g1XPBS 100mll 高糖 DMEM 培养基:抽滤保存在 4 度粉末全部碳酸氢钠 3.7gddH 02调 pH 值到:7.2-7.4 )定容到 1L(用盐酸1112l G418 母液(100mg/ml )用 0.22 mM 滤菌,分装 存于-20 度粉末 1gPBS 10mll zeocin 母液(100mg/ml )用 0.22 mM 滤菌,分 装存于-20 度粉末 1gddH2O 10mll Blasticidin(100mg/ml )用 0.22mM 滤菌,分 装存于-20 度粉末 0.3gPBS 10ml12
10、13(三)利用 His-tag 从细菌中纯化蛋白配方 透析液配方终浓度母液浓 量 取 体Tris-HCl(pH:8.0) 20mM13度1M积20ml溶解14NaClMgCl220mM2mM4M1M5 ml2 mlDTT1mM1M1ml甘油ddH O250%500472mlmll超声裂解液(lysis buffer):2011 年做蛋白纯化时用Na PO (164) 8.2g (50mM)3 4NaCl (58.5) 17.55g (300mM)加 800 mL ddH O 溶解,用 2M NaOH 或者22M HCL 调 pH 到 8.0,再定容到 1 升。配好后用 高压蒸气灭菌后常温保存。
11、洗涤液(wash buffer)l:2011 年做蛋白纯化时用Na PO348.2g(50mM )NaCl 17.55g (300mM )咪唑 0.681g (10mM)加 800 mLddH O ,根据开始的 pH 用 2M NaOH 或2者 2M HCL 调 pH 到 8.0,调好 pH 再定容到 1 升l 洗脱液(elution buffer):2011 年做蛋白纯化时用14溶解15Na PO348.2g(50mM )NaCl 17.55g (300mM)咪唑 17.025g (250mM) 加 800 mLddH O ,根据开始的 pH 用22MNaOH 或者 2M HCL 调 pH
12、到 8.0,调好 pH 再定容到 1 升)PrepEaseHistidine-Tagged Protein Purication Kits - High Speci cityl 8X LEW Buffer (Lysis-Equilibrium-Wash Buffer) :(室温保存)pH:8.0NaH PO .2H O 6.2404g (400mM) 2 4 2NaCl 14.0256g(2.4M)dH 02定容到 100 mL(调节 pH:8.0)l 4X Elution Buffer :(室温保存)pH:8.0NaH PO .2H O 3.1202 g 2 4 2(200mM )NaC l
13、7.0128g(1.2M )咪唑 6.81 g (1M) 1516dH 02(调节 pH:8.0)l EDTA: (100mM)定容到 100 mLEDTA 2.923 gdH 02定容到 100 mLl NiSO :4NiSO4.6H O 2.6285g2(100mM )dH 02定容到 100 mLl 溶菌酶:(使用时 1ml 溶液加入 20ul) 粉末 50 mgddH20 1mL16171718(四)利用 His-tag 从细胞中富集蛋白配方l 磷酸钠缓冲液按图示比例混合0.2 M Na HPO 溶液和0.22 4MNaH PO 溶液,得到两种缓冲液, pH分别调节成 2 4为8.0
14、和6.3.pH0.2 M Na HPO 体积 0.2 MNaH PO 体积2 4 2 46.38.0/mL11.2547.35/mL38.752.65l 细胞裂解液(最好新鲜配制,当天使用 )Cell终配配配配配lysisbuffer浓 10ml 15ml 20ml 40ml 30ml 度盐酸胍(g)6M5.73188.597711.463622.927217.19541819Tris(g) 1 0.01 0.01 0.02 0.04 0.030 2114 8171 4228 8456 6342 mMpH8.0buffer(ml)100mM5 7.5 10 20 15(注意胍盐是有害试剂注意这
15、里用的磷酸钠缓 冲液pH必须8.0!)(注意二价阳离子螯合剂,还原剂,会导致镍从 树脂上的洗脱)本实验的所有试剂中 EDTA浓度不得超过1 mM,DTT 浓度不超过5 mM,巯基乙醇浓度不超过20 mM。pH 8.0的洗脱溶液(最好新鲜配制,当天使用)pH 8.0 的终浓配配配配配wash度 100 50m 20ml 40ml 30mlbuffermll1920Urea 尿素(g)8M 48. 24. 9.60 19.2 14.4 048 024 96 192 144Tris(g) 10 mM 0.1 0.0 0.02 0.04 0.03211 605 4228 8456 6342 4 7pH
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子 实验室 细胞 常用 配方
链接地址:https://www.31doc.com/p-10898834.html