高等植物的PIN基因家族.doc
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1、高等植物的 PIN 基因家族刘士平1,2, 王璐1, 王继荣1, 薛艳红1,2, 寿惠霞1,*1 浙江大学生命科学学院植物生理学与生物化学国家重点实验室, 杭州 310058; 2 三峡大学化学与生命科学学院, 湖北宜昌443002PIN Gene Family in Higher PlantsLIU Shi-Ping1, 2, WANG Lu1, WANG Ji-Rong1, XUE Yan-Hong1, 2, SHOU Hui-Xia1, *1State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Life
2、 Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2College of Chemistry and Life Science, Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, China提要: PIN是一类编码生长素极性运输载体元件的基因家族, 影响着高等植物生长素的外向运输和众多生长发育过程。近年来该基因家族的相关成员陆续在不同物种中得到克隆。本文就 PIN 蛋白家族的结构、功能和活性调控的研究进展作一 介绍。关键词: 生长素; PIN基因家族; 极性运输; 生长发育; 高等植物生
3、长素是植物体内唯一具有极性运输( po la rauxin transport, PAT)特点的激素, 它主要在植物的 叶原基、幼叶以及根和发育的种子等部位合成(Muday等1995), 然后通过极性运输(主要是从茎顶 端向根尖)到达靶细胞来调节一系列生理反应。生 长素的极性运输影响着植物体的生长、发育、繁 殖等许多生理过程: 参与植物的形态建成和向性反 应, 调控组织的伸长生长及维管分化, 参与胚胎发育、光形态建成等(倪为民等 2000; 夏石头和萧浪涛 2003)。近年来随着一系列生长素极性运输相关 的突变体的分离(Chen 等 1998; Marchant 等 1999; Abas 等
4、2006), 人们对生长素极性运输的认识获得 了较大进展(李俊华和种康 2006; 刘进平 2007)。 IAA (indole-3-acetic acid, 吲哚乙酸)是植物体 内主要的内源性生长素, 它在组织内是从上一个细胞到下一个细胞进行极性运输的(M or ris 20 00 )。 除了少部分生长素可直接通过自由扩散从细胞壁进入细胞质, 大部分生长素都必须依赖于输入载体(influx carrier)和输出载体(efflux carrier)的协助才能 顺利进出细胞(Muday 和 DeLong 2001; Friml 和 Palme 2002)。这些运输载体都不对称地分布在细 胞膜上
5、的一端或一侧(极性分布), 从而控制着生长 素的极性运输。AUX1 蛋白是一类公认的输入载 体, 影响着生长素向胞内的输送(Marchant 等1999; Dharmasiri 等 2006)。此外, 细胞膜上的一些 PGP 蛋白(phosphoglycoprotein)既可以作为生长素输入 载体, 又可以作为输出载体行使功能(Blakeslee 等2005; Teale 等 2006; Blakeslee 等 2007)。PIN 蛋白家族是一种公认的生长素输出载体, 它们在细胞膜上也呈极性分布, 负责将生长素从胞 内运输到胞外。但到目前为止, PIN 蛋白的生长素 输出活性还没有生化方面的直
6、接证据, 故一般将其 描述为生长素输出载体的元件( e l e m e n t ) 、组分 (component)或促进剂(facilitator)。人们从拟南芥 (Arabidopsis thaliana)或其他物种中先后分离了 P IN1 、P IN2 、P IN3 、P I N4 和 P IN7 等基因, 并 证实这些基因参与植物器官的发生发育、根的向 地性及其他向性反应、根的伸长生长以及早期的 胚胎发育等过程。1 PIN 蛋白的结构高等植物的 PIN 蛋白家族成员之间有较高的同源性。序列比对结果显示, 水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)与拟南芥
7、对应的PIN蛋白之间的同源性为 32%85%, 表明 PIN 起源于同一个 祖先(Paponov 等 2005)。PIN 蛋白都是由位于两端 的两个疏水区和中间一个亲水区构成(图1), 其中每 个疏水区均有56 次跨膜折叠, 这种结构特点与其 所行使的跨膜运输功能一致。根据 PIN 蛋白亲水结构的差异可将其分为两类: 一类PIN 蛋白的亲水收稿资助修定2 0 0 9 - 0 6 -1 52 0 0 9 -0 4 -0 9国家重点基础研究发展计划(2 0 05 CB2 0 90 0 )和高等学校博士学科点专项科研基金( 2 0 0 7 0 3 3 5 0 8 1 ) 。通讯作者( E - m a
8、 i l : h u i x i a z j u . e d u . c n ; T e l : 0 5 7 1 -8 8 2 0 6 1 4 6 ) 。*图 1 PIN 蛋白结构预测(Zazimalova 等 2007)H 1 、H 2 : 疏水结构; C 1 、C 2 、C 3 : 亲水结构的恒定区; V 1 、V 2 : 亲水结构可变区。G l y /P : 糖基化或磷酸化位点。N 与 C 分 别表示蛋白的氨基端和羧基端。置均表现出异常(Okada 等 1991)。AtPIN1 蛋白预测有12个跨膜区, 与细菌和酵母的一些运输蛋白同 源。细胞亚定位的结果显示, AtPIN1 位于维管组
9、织中负责生长素极性运输的细胞的基部, 与化学渗 透偶联学说假设的负责生长素向基式输出载体 (basipetal efflux carrier)的定位一致(Galweiler 等1 9 9 8 ) 。AtPIN2 (又名 AGRI 或 EIR1)也是一种跨膜蛋 白(Chen 等 1998)。当 AtPIN2 在酵母中表达时, 放 射标记显示, IAA流出细胞的速度加快, 表明AtPIN2 调控着生长素的细胞输出。AtPIN2 在根中特异性 表达, 参与根的向地性反应, 调节着生长素在根部分生组织中的不对称分布(Friml 等 2004; Blilou 等2005)。此外, 在根毛细胞中超表达 A
10、tPIN2 会阻碍 根毛尖端的生长(Cho 等 2007), 进一步的研究表明 这是由于AtPIN2 促使胞内生长素水平低于根毛生 长的临界水平, 从而阻止根毛极性生长(Schlicht 等2 0 0 8 ) 的缘故。拟南芥的pin3突变体生长减弱, 向地性和向光 性丧失。在根冠细胞中, AtPIN3 能够响应重力刺 激迅速转位至侧面, 暗示AtPIN3可以通过控制细胞 中生长素的侧向分配而调控植物的向性生长(Friml 等 2 0 0 2 b ) 。AtPIN4在细胞中也呈极性分布, 其突变体与萘 基邻氨甲酰苯甲酸(1-naphthylphthalamic acid, NPA, 一种生长素极
11、性运输的抑制剂)处理的野生型表型 相似(Friml 等2002a)。pin4 的根尖生长素浓度提高 (即其中的生长素无法流出), 无法建立并维持根中 的生长素梯度, 静止中心和顶端根冠的起始细胞分区较短, 只有C1 区(恒定区1)和V1 区(可变区1); 另一类具有较长的亲水区, 包括 C1 、C2 、C3 结构 域和 V 1 、V2 等结构域。有实验表明, PI N 蛋白 的亲水区对于生长素的运输功能并不是必不可少 的, 但它对转运体功能的调控和PIN 蛋白的正确定 位是至关重要的(Zazimalova 等2007)。在疏水区C端与 V2 区之间有一 NPXXY (IM, 图 1)保守结构,
12、它调控着PIN 蛋白的内吞作用, 介导着小泡分拣过 程中膜蛋白与受体蛋白的互作。此外, 在 PIN 蛋 白的亲水区还有多个糖基化和磷酸化位点(图1), 这 些位点与 PIN 蛋白的功能调控密切相关(Blakeslee 等 2 0 0 7 ) 。2 PIN 蛋白的功能人们对 PIN 蛋白功能的认识最先起源于一些 突变体的研究。由于 pi n 突变体常表现出生长素 运输异常, 故推测PIN 蛋白可能与生长素的极性运 输有某种关系(Galweile 等 1998; Chen 等 1998); 生 物信息学也支持这一假说, 序列分析表明PIN 属于 膜运输蛋白(Morris 2000; Kwiatko
13、wska 2004)。一些生理生化实验进一步表明, PIN 蛋白是生长素极性运输的载体元件: PIN 蛋白的极性定位方式与生 长素流的运输方式相同(Benkova 等 2003; Friml 等2003); 其时空表达模式与生长素的运输高度一致 (Okada 等 1991; Peer 等 2004); 侧根原基起始时离 不开 PIN 蛋白运输的生长素浓度梯度(Benkova 等2 0 0 3 ) 。拟南芥的 pin1 是分离到的第一个 PIN 家族突 变体。突变体的花芽不能正常发育, 形成裸露的针 状花序, 并且侧生器官的数量、大小、形状、位裂异常, 表明AtPIN4参与根静止中心区的分生组织
14、中生长素浓度梯度的建成( S m i t h 等 2 0 0 6 ) 。与 AtPIN2 一样, 根毛细胞中超表达 AtPIN4 同样也会 阻碍根毛尖端的生长(Cho 等 2007)。AtPIN7维持着生长素的向基式运输, 其突变体 的胚胎极性发生异常( F r i m l 等 2 0 0 3 ; B l i l o u 等2 0 0 5 ) 。AtPIN5、AtPIN6 与 AtPIN8 的功能还不很清 楚, 但表达分析显示, AtPIN6 在侧根原基形成时大 量表达, 其启动子:GUS的组织染色表明PIN6位于 原分生组织中, 从而暗示PIN6参与组织或器官的分 化, 但pin6突变体在并
15、不发生明显的生长受阻现象 (Benkova 等 2003), 因此这些 PIN 家族成员功能的认识还有待进一步研究。单一的pin突变体往往只表现出轻微的突变表 型或没有表型, 而双突变体或多突变体则会严重地 阻碍植物的发育(Blilou 等2005)。在pin1 突变体内, PIN4 蛋白会扩展到原本 PIN1 所处的位置,说明不 同的 PIN 蛋白之间存在着功能冗余现象(Blilou 等2005)。有实验证明, PIN 成员的这种冗余现象是广泛存在的, 而且成员之间还存在各种各样的交错 调控和反馈调节(Blilou 等 2005)。迄今为止, 除了拟南芥以外, 人们还在水稻、小麦和玉米(Ze
16、a mays)等植物中克隆到许多PIN同源基因(Xu 等 2005; Paponov 等 2005; Carraro 等2006) (图 2), 有实验表明, 这些 PIN 蛋白有着类似 的功能。水稻中 OsPIN1 与拟南芥中的 AtPIN1 相 似, 主要在维管组织或一些侧生器官中, 如侧根和 不定根的原基上表达。下调表达OsPIN1 会显著影 响水稻不定根和分蘖的数量(Xu 等 2005)。免疫荧光实验也显示, 玉米的 ZmPIN1a 和 ZmPIN1b 极性分布在细胞的一端, 在花序发育异常的突变体 bif2 (barren inflorescence 2)中 ZmPIN1a 和ZmP
17、IN1b 的 极性分布也发生改变(Carraro 等 2006)。3 PIN 的表达特异性高等植物中的所有 PIN 蛋白都极性分布在细 胞的一侧或一端, 与生长素的极性运输一致。此 外, PIN 蛋白还具有组织特异性或细胞特异性的特 点(图3), 不同的PIN家族成员表达的部位不尽相同 (部分存在功能冗余的 PIN 除外)。这些 PIN 基因时空表达的特异性(图3)与生长素的极性运输高度 相关(Okada 等 1991; Peer 等 2004), 而且多个高度 保守的PIN基因的存在, 表明生长素在植物体内的 运输存在多条路径, 反映了生长素极性运输的复杂 性(Vieten 等 2005),
18、 也从另一个侧面证实 PIN 家族 调控着植物不同的生长发育过程。图 2 PIN 家族的亲缘关系(Paponov 等 2005)At: 拟南芥; O s : 水稻; Ta : 小麦。图 3 胚胎(左)和根尖(右)中 AtPINs 蛋白成员的定位(Blilou 等 2005; Vieten 等 2005)AtPIN1 定位于根或地上部分的维管组织及胚胎中, 参与根系和分蘖等多种器官的发育调控 (Galweiler 等 1998)(图 3)。AtPIN2 仅在根中表达, 其转录定位于根部因重力刺激发生弯曲的区域, 在 根毛的发生区域也观测到AtPIN2的大量表达(Friml 等 2004; Bli
19、lou 等 2005)。AtPIN3 的分布较广, 在 根分生组织的中柱鞘细胞( p e r i c y c l e ) 、根冠柱 (columella)以及幼芽的内皮层(endodemis)细胞中都 可以观测到其表达(Friml 等 2002b)。AtPIN4 在根 静止中心(quiescent center)区域表达, 对维持分生组 织中生长素的浓度梯度至关重要; 此外, 它还在胚 胎的极性建成时大量表达(Smit h 等 200 6)。同样 AtPIN7在根冠和胚胎中表达, 它在维持生长素的向 基式浓度梯度时起作用(Friml 等 2003; Blilou 等2 0 0 5 ) 。这些
20、PIN 家族成员表达的时空特异性并不是 一成不变的。如前面已经述及的, 由于功能冗余性 的广泛存在, 当一个 PIN 发生突变时, 其他家族成员可能会改变表达模式以抵消因突变对植物体所造成的不良影响(Blilou 等 2005)。再有, PIN 蛋白的 亚细胞定位(即分布在细胞的一端或一侧)还将具有 动态变化特点, 这种极性分布的改变既受植物自身 生长发育的制约, 又受外界环境变化的影响(下文详 述), 因此认为PIN 蛋白极性位置的变化会影响PIN 蛋白的功能。4 PIN 蛋白活性的调控PIN蛋白的活性影响着植物体的生长发育, 近 年来的研究表明, PIN 蛋白的活性调控可归纳为 4种形式:
21、 极性定位的调控; 基因表达的调控; 生长素运输抑制剂的调控和磷酸化调控。4.1 极性定位的调控 PIN 蛋白一经合成后即进入 囊泡运输系统, 在此过程中PIN 蛋白的极性分布能 够迅速响应内部生长发育信号和外界环境的变化 (Oka da 等 19 91 )。免疫化学定位研究表明, 含有 AtPIN1的内吞囊泡在胞膜和胞内细胞器(主要是内 体, endosome)间循环运输, 可以实现PIN 蛋白的极 性分布。一旦内体返回细胞膜的能力受到抑制后, PIN 蛋白的分布就会发生改变。PIN 蛋白的极性变 化有两种可能: 一是PIN蛋白的膜定位功能丧失或 下降, 转而在胞质或胞内区室中分布; 二是原
22、本分 布在细胞的一端或一侧的PIN蛋白却分布在相反的 方向。真菌毒素布雷菲尔德菌素A (brefeldin A, BFA) 是一种公认的囊泡运输抑制剂。以 BFA 处理细胞 后, AtPIN1 在膜上正常的极性分布即发生改变, 大 多数 PIN 蛋白聚集在胞内细胞器中(有人将这一结 构称为 BFA 腔室)。除去BFA 后, AtPIN1 即迅速恢 复到正常的极性定位( G e ld n e r 等 2 0 0 1 ) , 这表明 AtPIN1 依赖囊泡的靶向运输是一个动态过程。如果拟南芥的GNOM 基因发生突变即会改变细胞的囊泡运输, 从而影响 P I N 1 的极性定位。GNOM 蛋白是一种
23、大型的ARF-GEF, 即 ADP 核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, ARF)的鸟苷酸 交换因子(guanine-nucleotide exchange factor, GEF), 是小 G 蛋白 ARF 的分子开关, 而 ARF 在蛋白质的 小泡运输中起作用(Mouratou 等 2005)。最早报道的是gnom突变体发育存在严重缺陷, 胚胎畸形, 下胚轴缺失, 根系发育异常, 侧根显著减少和根的向 地性出现部分缺失, 一般在幼苗早期便会死亡 (Mayer 等 1991; Shevell 等 1994; Friml 等 2003)。后 来的研究认为GNOM位于内
24、体中, 介导着生长素输 出载体元件 PIN1 向胞膜的运输。在 gnom 突变体 中, 不管是在胚胎还是在根部, 生长素输出载体元件 P I N 1 的细胞极性定位均丧失( S t e i n m a n n 等1999)。我们实验室的研究结果表明, 水稻 gnom1 突变体不定根缺失, OsPIN1蛋白的极性分布也发生 变化( 未发表资料) 。GNOM 与 BFA 都通过影响囊泡运输而影响PIN 蛋白的分布, 这两者到底是什么关系呢?现在 越来越多的证据证实, BFA是通过GNOM的作用而 调控PIN 蛋白的极性定位。有研究指出, 将GNOM 催化区域的第696位的甲硫氨酸人工改造成亮氨酸
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