基因工程实验课件.ppt
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1、基因工程实验,1,基因工程大实验E.Coli 感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定,基因工程实验,2,一、 实验目的和要求 1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术;2、了解质粒DNA的特性,掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法;3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法; 通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。,基因工程实验,3,二、实验原理 1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态,可以通过物理与化
2、学方法诱导形成,也可以自然形成,在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统(Restriction-Modification)缺陷的变异株,以防止对导入的外源DNA的切割,用符号R-M-表示。其基本原理是:细菌处于0的CaCl2低渗溶液中,会膨胀成球形,细胞膜的通透性发生变化,转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经过42短时间的热激处理,,基因工程实验,4,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富的培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖,在选择培养基上可获得所需的转化子。 2、碱裂解法小量制备质粒DNA:碱裂解法是基于线性
3、大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性、复性的差异达到分离目的的,在pH12.012.6的碱性环境中,线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂,双链解开而变性,但质粒DNA由于其闭合环型结构,氢键仅发生部分断裂,而且其互补链不完全分离;当将pH值调节到中性并在高盐浓度下,已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构,通过离心,大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白,基因工程实验,5,质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性,恢复到原来的构型,呈可溶性状态保存与溶液中,离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。
4、3、限制性内切酶:又称为内切酶或限制酶,是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶,是体外剪切基因片段的重要工具,主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性, 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、III型三大类,类和III类限制性内切酶,在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点,但却随机地切割回,基因工程实验,6,转到被结合处的DNA。类限制性内切酶在识别位点上切割,然后从底物上解离下来。故类和限制酶在基因工程中基本不用,II类酶在分子克隆中使用广泛,其基本特点如下: (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列,如EcoR
5、I识别与切割序列为5GAATTC3 3CTTAAG5 (2) 、识别的核苷酸数目大多数为46个,少数识别813个; (3)、识别序列大多数为二重对称(回文序列),大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端:,基因工程实验,7,(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列,甚至切割的位点也相同,称为同裂酶或异源同工酶,如Hpa II与Msp I;有的识别位点不同,但对DNA切割后可产生相同的粘性末端,称为同尾酶,如BamH I与Bgl II。,基因工程实验,8,影响核酸限制性内切酶活性的因素: DNA的纯度; DNA的甲基化程度; 酶切消化反应的温度; DNA的分子结构; 溶液中离子浓度及种类;
6、缓冲液的 pH值。 4、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质 (密度与琼脂糖浓度相关);而生理条件下,核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态,因此将核酸分子置于电场中时,它们会向正极迁移,由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子,比分子量较大的DNA分子,具有较紧密的构型,所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染色,可
7、确定DNA在胶中的位置。,基因工程实验,9,影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素: DNA的分子大小; 琼脂糖浓度; DNA构象; 电场强度; 碱基组成与温度; 嵌入染料的存在; 电泳缓冲液的组成。 三、实验材料与设备: 1、用品与与仪器: 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪,凝胶成像仪、冰箱、制冰机等; 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒,基因工程实验,10,镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸,一次性塑料手套等; E.coli
8、DH5受体菌(R-M-), pTRE2hyg质粒(AmpR) 2、试剂: LB培养基:蛋白胨 10g/L,酵母提取物 5g/L, NaCl 10g/L,琼脂粉 15g/L(固体培养基),用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0,高压灭菌; 氨苄青霉素贮存液:浓度50-100mgmL; 含有抗菌素的LB平板培养基:将配置好的LB固体培养基高压灭菌后,冷却到60度左右,加入氨苄青霉素(终浓度为50gmL浓度50-100gmL);,基因工程实验,11,0.1mol/LCaCl2:称取1.1g进口无水CaCl2,溶于70mL双蒸水中,定容到100mL,过滤后灭菌; 0.1mol/LCaCl2 15
9、甘油:100ml 0.1mol/L CaCl2 溶液内含有15ml甘油,高压灭菌; 溶液I: 50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA (pH8.0), 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0); 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用); 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸,28.5mL H2O); RNase A: 10mg/ml; TE缓冲液: 10mmol/L,Tris-HCl, 1mmol/L,EDTA,pH 8.0;,基因工程实验,12,5TBE缓冲液:0.45mo
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