基因工程课件.ppt
《基因工程课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因工程课件.ppt(59页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、基因工程,1,第七章 基因工程 (gene engineering),基因工程,2,重组DNA医药产品,基因工程,3,第一节 重组DNA技术的原理,重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作过程。 也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元素。,基因工程,4,基因工程的操作过程,目的基因的获取,克隆载体的构建,外源基因与载体的连接 (体外重组),重组DNA导入受体菌,转化子的筛选和鉴定,克隆基因的表达,基因工程,5,目的基因的克
2、隆:,基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。 一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类: 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆; 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。,基因工程,6,第二节 核酸的提取及检测,就基因工程而言,核酸分子是其研究所涉及的主要对象,所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。 核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,基因工程,7,1. 基因组DNA的分离与纯化,DNA主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有
3、少量DNA,如线粒体DNA(mtDNA),叶绿体DNA(cpDNA), 质粒DNA。 总的原则: 保证一级结构的完整性; 排除其它分子的污染;,基因工程,8,一般步骤:,(1) 破碎细胞,裂解细胞壁 机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆 化学方法: SDS(阴离子去垢剂) EDTA,使得DNase失活(why?) 酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶 (2) 通过蛋白质变性或分解,使 DNA游离出来 (3) 分离DNA,基因工程,9,2. cDNA的分离与纯化,(1)总RNA 的提取 RNase,不需辅助因子,耐酸碱,分布极广 RNase的来源 外源:操作者,实验器皿,试剂,空气 内源:不同组织和细胞数
4、量不同 创造无RNase的环境 DEPC(焦碳酸二乙酯)(配成0.1%的DEPC 水) 异硫氰酸胍 Trizol试剂,基因工程,10,逆转录过程中cDNA的合成,基因工程,11,Trizol试剂 Trizol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。,基因工程,12,0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。 异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白
5、质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。 -巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。,基因工程,13,Trizol法提取总RNA的实验原理: Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。 RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。 在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。,基因工程,14,(2)第一链的合成,基因工程,15,(3)第二链的合成,cDNA第二链的合成方法自身引
6、导法,基因工程,16,自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割 发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列 出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。,基因工程,17,cDNA第二链的合成方法置换合成法,利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链,不用碱变性(水解mRNA),而是在dNTPs存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。 从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶的作用下合成第二链。,基因工程,18,cDNA第二链的合成方法置换合成法,DNApol dNTPs,RNaesH,AAAAAAAAAAAAAAO
7、H 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAp 5,5,S1,AAAATTTOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,TTTTTTTTTTTTTTOH 3,AAAAAAAAAAAAAA 5,5,TTTTTTTTTTTTTT 3,3,T4-DNA ligase,该方法使用较多,基因工程,19,3. 质粒DNA的分离与纯化,质粒(plasmid): 指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位 共价闭合环状 质粒DNA的分离:细菌培养和质粒DNA扩增;细菌菌体的裂解;质粒DNA的分离,基因工程,20,质粒DNA的提取碱裂解法的原理,染色体DNA比质粒D
8、NA分子大得多,且染色体DNA为线状分子,而质粒DNA为共价闭合环状分子; 当用碱处理DNA溶液时,线状染色体DNA容易发生变性,共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象; 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀,而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中,从而可通过离心将两者分开。,基因工程,21,4. 核酸的检测,包括DNA的质量、大小、纯度检测 紫外分光光度法 dsDNA:1A26050ug/ml; ssDNA: 1A260 37ug/ml ; RNA:1A260 40ug/ml; 寡聚核苷酸:1A260 30ug/ml; A260/A280 1.65
9、1.85(DNA); 1.7 2.0(RNA) 比值低,有蛋白质、酚类等污染(why?) 凝胶电泳法,基因工程,22,凝胶电泳技术,样品的物理性质 分子大小、电荷、空间构型 支持物介质 琼脂糖,100-60000bp, 聚丙烯酰胺,1-500bp 电场强度,5V/cm 缓冲液离子强度 TAE, TBE, TPE,基因工程,23,电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液,用以稳定体系酸碱度。 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应,长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力,使溶液两极的pH保持基本不变。,基因工程,24,
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程 课件
链接地址:https://www.31doc.com/p-11262629.html