基因工程酶课件.ppt
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1、1,第二章 基因工程 Gene engineering,2,基因工程的定义,应用DNA重组技术,按照人们的意愿,在基因水平上改变生物遗传性,创造新生物物种,通过工程化为人类提供有用产品和服务的技术。,3,内 容,基因工程工具酶 基因工程载体 DNA提取与基因制备 重组DNA向宿主细胞内转移技术 重组基因的表达调控,4,基因工程的技术流程,5,工具酶基因工程技术中能用于DNA和RNA 的合成、连接、切割和修饰的各种酶。包括:限制酶, 聚合酶, 连接酶, 修饰酶(激酶, 磷酸酶,核酸酶, 甲基化酶),蛋白酶,溶菌酶 等。,第一节 基因工程工具酶,6,一、限制性内切酶 (Restriction En
2、donuclease),1. 细菌的限制一修饰现象被发现 phage 侵入 E.coli 可繁殖 phage 侵入 另一种E.coli 不可繁殖 瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论: 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA,7,1968年,Meselson从Ecoli K株中分离出了第一个限制酶EcoK;同年Linn和Arber从 Ecoli B株中分离到限制酶EcoB。 美Hopkings大学 H.Smith从流感嗜血菌中分离 型 限制酶 Hind Arber, Smith获得1978 年Nobel奖,8,2. 限制性核酸内切酶的定义和生物学功能,定义:凡能识别和
3、切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶,称为限制性核酸内切酶,简称限制酶。,生物学功能: A. 防御外来生物在体内繁殖。 B. 限制-修饰系统决定了噬菌体、病毒等具有种属特异性。 C. 阻止了生物远距离种属间杂交优势。,9,Hind III 属名 种名 株名 序数 含义:流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzae d)的第三种酶,3. 限制酶的命名,第1个字母是产生该酶的细菌属名的第一个字母,大写; 第2-3个字母 是细菌种名的前两个字母,小写; 第4个字母是株名的第一个字母,小写; 用罗马数字表示发现的先后次序。,10,4. 限制酶系统分类,1985年后大量限制酶被发现,
4、 到2005年1月,已经发现 3681种限制酶。 限制性内切酶的分类 型: 特异识别、随机切割 型: 特异识别、同点切割 型: 特异识别、异地切割通常所指的限制酶即类酶,11,限制酶特性比较,I型 II型 III型举例 EcoB BamHI EcoPL 亚基 三种不同的亚基 两个相同的亚基 两种 活性 限制酶、修饰酶 限制酶 限制酶、修饰酶酶反应辅助因子ATP.mg+ SAM mg+ ATP.mg+SAM识别位点特性 / 4-6bp回文对称 /识别位点 TGAN8TGCT GGATCC AGACC 切割位点 可变,距离1kb 识别位点中 距3端24-26bp克隆工作中用途 无 有 无 SAM:
5、 硫一腺苷甲硫氨酸,12,5. II型限制酶的识别特点 A. 识别顺序一般为4-7 bp B. 识别切割位点具有旋转对称性(回文结构),4bp HpaC CGG Hae GG CC 5bp Ava G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG,13,6. 限制酶的切割末端 平端:缺口在识别序列对称轴上(Hind I I ) 5粘端:缺口在对称轴5端一侧(EcoR I) 3粘端:缺口在对称轴3端一侧(Pst I),限制酶产生的末端的连接 A. 匹配粘端: 直接连接B. 平末端: 万能连接C. 不匹配粘端: S1 Nuclease切去突出端或Klenow
6、补平,14,7. 识别位点与切割方式之间的关系 A.识别不同,切割不同 eg: BamHI EcoRI -G GATC C- - A GATCT- -C CTAG G- - T CTAG A- B.识别不同,切割产生末端相同(同尾酶) eg: BamHI Bg1 - A GATCT -G GATCC - T CTAG A -CCTAG G,15,C.识别相同,切割不同 eg: SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGGG - -GGG CCC- -G GGCC C-D.识别相同,切割相同同工酶 同裂酶 eg: Hpa Msp -CCGG- -C * C GG- -GG CC- -G G
7、 CC-甲基化后不可切割 甲基化后仍可切割,16,8.限制酶反应的影响因素1. 温度:一般37C 有例外,如:SmaI 25C, BclI 50C,TaqI 65C2. 缓冲液:高、中、低盐之分 3. 时间:1-2小时4. 反应体积和甘油浓度:酶1/10体积5. DNA纯度与构型:,17,A. 纯度:RNA,蛋白,氯仿,SDS,EDTA, EB,酚,乙醇,硫酸根,DNAB. 构型:切超螺旋需更多的酶 例: lg DNA, EcoRI 切, 1U 超螺旋 pUCl9, EcoRI 2.5U Hind 5U Sal I 10U Nar I 20U,18,酶单位的定义: 1U:指在适当的温度和缓冲液
8、条件下,1小时内完全酶解ug特定底物所需要的酶量。,缓冲液 NaCl 0, 50, 100mmol/L离子强度 Tris-HCl pH7.5-8.0 MgCl2 辅助因子 10mmol/L DTT 抗氧化,保护还原性基团 1mmol/L BSA 使蛋白酶稳定 100ug/mL,19,近末端的切割: eg: AccI GGTCGACC 切不动 CGGTCGACCG 切不动 CCGGTCGACCGG 切不动 eg: EcoRI GGAATTCCCGGAATTCCG 2小时内90%完全酶切 eg: PmeI GTTTAAAC20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时,25%切开 GGGTTTAA
9、ACCC 20小时,50%切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时, 90%切开,20,星活性(Star Activity)识别专一性下降 eg: EcoRIGAATTC EcoRI* AATT原因:甘油浓度过高,酶浓度太大, 离子强度不适,pH不适(Ph8.0) 存在有害试剂(1%乙 醇, DMSO, 乙二醇) 阳离子变化:Mn+, Co+, Zn+, Cu+代替mg+,21,酶的灭活,65加热15分钟 加入EDTA至终浓度10mM终止反应,琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶 200bp50kb 水平装置 聚丙烯酰胺凝胶 5-500bp 垂直装置,22,. 按下表分
10、别加入各试剂于Eppendorf管中(注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作)。 DNA g 10buffer 2.5l 无菌水 内切酶 2 总体积: 25l . 将反应体系充分混匀,并于台式离心机上短暂离心。 . Eppendorf管于37水浴保温2小时,使酶切反应完全。,酶切操作技术,23,. 取l反应液加Loading buffer混匀,于琼脂糖凝胶上电泳。 5. 紫外凝胶成像系统上查看实验结果。,24,限制酶的应用:1. restriction map 2. DNA physical map :a series of ER3. gene library construction,appl
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