实验五、碱性磷酸酶米氏常数的测定.doc
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1、实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定目的要求1 学习分光光度法测定的原理和方法2学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度 ($)的测定原理和方法,测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的绻和$值。、原理、分光光度法的基本原理及方法一)利用吸收光谱对物质进行定性分析1.原理0 1005500-图11维生素B】2溶液的吸收光谱曲线2.主要方法:(1) 比较吸收光谱曲线(2) 比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm,核酸的最人吸收波长 为260n m。2$24U 250 2S0 27U 280 2&0 300 波长芳呑濮如哉的些外吸收0 pNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物p
2、NP的含量,求岀反应速度Vo三、试剂与器材试剂:0.5ptmol/mL pNP、10 mmol/L pNPP、20 mmolL MgCI2 0.1 mol/L 碳酸钠一碳酸氢钠 pH 10.1 缓冲液、0.1 mol/L NaOH、6 |ng/mL碱性磷酸 酶酶液器材:f旦温水浴锅、722分光光度计四、分光光度计的使用1. 722型分光光度计的外形2仪器操作键介绍“方式设定”键(MODE):用于设置测 试方式“100%T/0ABS”键:用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键:用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮:用于设置分析波长3 样品测试操作 打开
3、电源开关,使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将耍使川的分析波 k位晝上打开样品室盖,将挡光体插入比色皿架,并将其推或拉 盖好样品室盖,按“0%T键调透射比零 取出挡光体,盖好样品室盖,按“100%调100%透射 比 按“方式键” (MODE)将测试方式设置为吸光度方式 (A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 卬,盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中,按“100%T”调零A 将被测溶液拉入光路中,此时,显示器上所显示是被测 样品的吸光度参数实验完成后,关闭电源,洗净比色皿,并盖好盖布。五、操作方法(一)对硝基苯酚标准曲
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