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1、 中性粒细胞碱性磷酸酶染色检查的标准操作程序(SOP)实验室名称项 目编 号制定日期细胞室中性粒细胞碱性磷酸酶染色*年*月*日【目的】指导中性粒细胞碱性磷酸酶染色检查。【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字:专业主管、质控主管、科主任。【用途】1) 鉴别白血病(低)和白血病样(高)反应。2) 鉴别淋巴瘤(高)和何杰金病。3) 鉴别细菌性感染(高)与病毒性感染。【染色原理】基质中甘油磷酸钠在碱性磷酸酶与触媒剂镁离子的存在下,水解成磷酸钠与甘油,磷酸钠再与氯化钙结合成不溶解的磷酸钙,再与硝酸钴形成磷酸钴,最后与硫化铵成为黑色的硫化钴沉淀。
2、【分布】血细胞的碱性磷酸酶(简称“碱酶”)活性,主要见于成熟的中性粒细胞(故称NAP),定位于胞浆中。但当碱酶的活性极强时,由于扩散作用常可使黑色沉淀遮盖于胞核上。其他细胞系均为阴性反应。【试剂配置】1.作用液3%甘油磷酸钠 10ml2%巴比妥钠水溶液 10ml蒸馏水 20ml2%氯化钙 20ml2%硫酸镁 2ml PH9.2-9.5为适当。2. 2%硝酸钴(冰箱保存可用12个月)。3. 1%硫化铵(用时新配,每50ml分装1瓶,冰箱保存)。4. 0.5%伊红、1%藏红或2%甲绿溶液。【染色步骤】a) 新鲜干燥的涂片固定于95%酒精中10分钟。b) 水洗数次,晾干。c) 加入37作用液中,孵育
3、46小时(作用液事先预温30分钟)。d) 自来水缓缓冲洗数次,待干。e) 2%硝酸钴5分钟。f) 水洗,待干。g) 1%硫化铵5分钟(此液只能用4小时)。h) 自来水冲洗,再用蒸馏水涮洗,待干。i) 0.5%伊红复染3分钟或2%甲绿复染10分钟。j) 水洗,晾干,镜检。【对照样本】选择已知酶活性强的标本与被检标本同时染色,如所染阳性样本未呈现应有的阳性反应,说明染色技术有问题。【结果判断】1.阳性颗粒呈棕黑色(与过氧化酶阳性颗粒相似,但粒小色淡),定位于成熟中性粒细胞胞浆内。2.计数方法,按碱酶活性强弱,分为5级。0级 胞浆呈原色,无颗粒。级 胞浆呈浅棕色和浅灰色,小颗粒占胞浆面积2550%级
4、 胞浆呈棕色片状沉淀,小到中等颗粒约占胞浆面积的5075%。级 胞浆充满棕黑色沉淀,分布均匀,中到大颗粒占胞浆面积的75100%。级 胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀,甚至遮盖胞核,中到大颗粒占胞浆面积的100每例的血片,均计数100个中性粒细胞,求出碱性磷酸酶阳性细胞的百分比(阳性率),并按碱酶活性的强弱不同,求得阳性指数(积分)。【临床意义】1.正常人:中性粒细胞的碱性磷酸酶活性较弱,阳性率为50%左右(2080%),阳性强度多为+,积分为80左右(60100)。2.炎症感染:各种化脓性感染,中性粒细胞的碱性磷酸酶活性显著增加。病毒感染,则变化较小。3.白血病样反应:碱酶活性增高最显著,阳性
5、率为50100%。阳性强度全部为+或+,积分为200左右(80380)。4.白血病1)粒细胞性:急性、亚急性、慢性白血病和绿色瘤皆剧减,慢性之积分可降为0。接受治疗缓解时可恢复正常,复发时可再度降低。2)单核细胞:血涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶活性降低(积分多为0)。3)淋巴细胞性:急性白血病、淋巴肉瘤、中性粒细胞的碱性磷酸酶活性增强。5贫血:各种贫血,其中性粒细胞的碱性磷酸酶的活性皆增高,尤以再生障碍性贫血最显著。6. 其他疾患:如多发性骨髓瘤、原神经细胞瘤、风湿热、糖尿病、真性红细胞增多症,以及外科手术后,中性粒细胞的碱性磷酸酶活性都有所增高。【注意事项】1. 含有甘油磷酸钠的基质作用液必须新鲜配置,置冰箱中待用,两天内有 效。2. 作用液的PH值,必须在9.4左右(以1N或0.2mol/L NaOH纠正)。3. 每次实验应同时作阳性标本为对照。4. 中性粒细胞的碱性磷酸酶活性在不同状态下的改变:年龄:1岁以下的幼儿较高,60岁以上的老人较低。性别:女性较高。时间:清晨到中午逐渐增高,到下午6时以后又开始降低。当垂体、肾上腺皮质功能亢进时:中性粒细胞碱酶的活性剧增。在体温增高、代谢旺盛、妇女的经期及妊娠时:中性粒细胞的碱性磷酸酶活性均有所增高。操作人员 部门主管 质量负责人姓名 王烈 日期 04年07月15日
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